木棗果實生長過程中細(xì)胞壁酶活性變化的研究

陳國梁 任彤 祖歡歡 陳春 張睿 徐露 王旭東 陳宗禮

摘要：以不同生長期木棗（Ziziphus jujube Mill.）果實為材料，測定果實纖維素酶（Cx-cellulase）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、果膠甲酯酶（PME）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）等4種細(xì)胞壁酶的活性，探究其與木棗果實生長發(fā)育的相關(guān)性。結(jié)果表明，在整個生長過程中，Cx-cellulas酶活性相對平穩(wěn)上升，β-Gal酶活性從全紅期到完熟期迅速達(dá)到最大值，PME活性從半紅期到全紅期迅速下降;PG酶活性在完熟期明顯升高;推測Cx-cellulase與木棗果實膨大相關(guān)，是木棗軟化的重要物質(zhì)之一;PME在啟動木棗果實的轉(zhuǎn)色中起作用;β-Gal和PG則在木棗果實成熟期起關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：木棗（Ziziphus jujube Mill.）;果實;生長過程;細(xì)胞壁酶;酶活性

中圖分類號：S665.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）16-0096-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.021? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Using the fruit of different growing period of jujube （Ziziphus jujube Mill.） as materials，the activity of cell wall enzymes of cellulase（Cx-cellulase）， β-galactosidase（β-Gal）， pectin methylesterase（PME）， and polygalacturonase（PG） were observed and discussed the related to the jujube fruit growth processes. The results showed that： in the whole growth， Cx-cellulase was rised stablely， β-Gal reached maximum from full red stage to full ripe stage， PME reduced from half red stage to full red stage， and PG was rised in full ripe stage. It was speculated that Cx-cellulase was related to fruit enlargement of jujube， and it is one of the important substances of softening of jujube fruit. PME may be played a role in starting discolour， β-Gal and PG play a key role in the mature period of jujube fruit.

Key words： jujube（Ziziphus jujube Mill.）; fruit; process of growth; cell wall enzyme; enzyme activity

棗（Ziziphus jujube Mill.）屬鼠李科棗屬，其鮮果富含人體必需的多種礦物元素[1]，近年來，隨著人們對鮮棗營養(yǎng)價值的重新認(rèn)識及其極好的口味，市場需求增長迅速。但鮮棗采后果肉易腐爛褐變，不耐貯藏，大大縮短了鮮棗的貨架期[2，3]。研究表明，大多果實成熟、極度軟化等都與細(xì)胞壁酶系有關(guān)，是一系列酶相互作用的結(jié)果[4]。近年來，有關(guān)細(xì)胞壁酶對果實生長、成熟、衰老等的作用在蘋果[5]、樹莓[6]、梨[7]等方面的研究均有報道，且主要集中在Cx-cellulase、β-Gal、果膠甲酯酶（Pectin methyl esterase，PME）和多聚半乳糖醛酸酶（Poly galacturonase，PG）等細(xì)胞壁酶對果實生長、成熟、衰老等的作用，而有關(guān)棗果實的研究鮮見報道。因此，本研究通過測定木棗果實不同生長時期細(xì)胞壁酶活性變化，從中找出其與木棗果實生長發(fā)育以及成熟軟化的相關(guān)性，為棗果成熟、衰老的生理生化機理研究提供參考，也可為棗果實生物保鮮、延長貨架期提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

從陜西省延安市寶塔區(qū)張新莊村采摘大小均勻、無病蟲害和無機械損傷的木棗果。采取成熟度為幼果期（8月6日）、青果期（8月21日）、泛紅期? ?（9月5日）、半紅期（9月20日）、全紅期（9月27日）、成熟期（10月4日）、完熟期（10月11日）的果實;清水洗凈，當(dāng)天液氮速凍帶回，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品的預(yù)處理? 從冰箱中隨機抽取木棗果實10顆，于低溫下去核、破碎、研磨，混勻備用。

1.2.2? 粗酶液的制備? 參考黃志明等[8]的方法，取預(yù)處理過的樣品1.0 g加入5倍體積pH 5.0的檸檬酸緩沖液，冰浴研磨，15 000 r/min離心20 min，所得上清液即為粗酶液，用于酶活性測定。

1.2.3? 酶活性的測定? Cx-cellulase、β-Gal、PME和PG 4種細(xì)胞壁酶的活性測定參考文獻(xiàn)[8-11]的方法，分別測定OD540 nm、OD400 nm、OD520 nm和OD274 nm。其中Cx-cellulase酶活力以每分鐘光密度變化1.0的酶量為1個酶活力單位，其余3種酶活力以每分鐘光密度變化0.01的酶量為1個酶活力單位，均以U/g（FW）單位計。所有測定以煮沸5 min的粗酶液為對照，試驗均重復(fù)3次。

2? 結(jié)果與分析

2.1? Cx-cellulase酶活性變化

Cx-cellulase酶活性從木棗幼果期至完熟期基本呈平穩(wěn)上升的趨勢（圖1），推測Cx-cellulase是木棗果生長發(fā)育的主要酶之一。但該酶在泛紅期到全紅期較其他時期活性上升快（上升27.4%），而該時期正是木棗果實迅速生長膨大期，表明Cx-cellulase可能在其生長中期與果實迅速生長膨大密切相關(guān)。

2.2? β-Gal酶活性變化

β-Gal酶活性從木棗幼果期開始持續(xù)下降到全紅期降至最低，此時酶活性僅為幼果期的28.27%，之后迅速上升，到完熟期達(dá)最高，是全紅期酶活性的4.6倍（圖2）。說明β-Gal與木棗果實的發(fā)育初期及迅速生長階段呈負(fù)相關(guān)，與成熟期呈正相關(guān)，推測該酶在后期成熟階段發(fā)揮重要作用，是木棗果實成熟的關(guān)鍵酶之一。

2.3? PME酶活性變化

木棗PME酶活性從幼果期開始上升至泛紅期達(dá)到最大值[48.4 U/g（FW）]，該階段恰好是棗果生長發(fā)育時期，從泛紅期到全紅期迅速下降（71.69%）（圖3）。這表明PME與木棗果實的轉(zhuǎn)色啟動可能密切相關(guān)，在木棗果實生長前期起重要作用，而在其成熟后期作用不大。

2.4? PG酶活性變化

PG酶活性在木棗果實生長過程中有2個明顯的變化，青果期是幼果期的1.28倍，完熟期是成熟期的1.30倍，且這2個階段酶活性變化基本一致（圖4）。這表明PG可能與木棗果實的生長相關(guān)，而且在成熟階段發(fā)揮重要作用。

3? 小結(jié)與討論

不同的細(xì)胞壁水解酶在果實成熟軟化的不同階段起不同作用，不同酶類對不同果品影響也不同，其相互作用共同促進(jìn)并調(diào)控果實軟化[12]。研究表明，木棗在完熟期時達(dá)到成熟[13]，Cx-cellulase在鱷梨、獼猴桃、甜櫻桃等果實軟化中起重要作用[14]，β-Gal對果實的成熟、軟化起一定作用[15]。該試驗中，Cx-cellulase、β-Gal和PG活性在木棗果實完熟階段均呈升高趨勢，且達(dá)到最大值，可能都與木棗果實成熟軟化密切相關(guān)。這與溫陟良等[16]在贊皇大棗果實中對β-Gal酶活性的研究基本一致，而在測定蘋果β-Gal酶活性時發(fā)現(xiàn)，β-Gal并不是蘋果軟化的限制因子[14]。表明不同的果實中β-Gal起不同的作用;PME能夠水解果膠分子中甲酯化的C6羧基，改變細(xì)胞壁的pH和電位，使果膠結(jié)構(gòu)更易被PG降解，是PG作用的必要前提[17，18]，且PME在木棗軟化時期有前導(dǎo)作用[13]。PG參與果膠多糖的降解，膨脹細(xì)胞壁，使果實軟化[19]。該試驗中PME酶活性在泛紅期時最大，此時PG酶活性正在上升，當(dāng)PME活性基本穩(wěn)定時，PG酶活性達(dá)到高峰，且其活性高峰遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于PME，PG在木棗果實成熟后期扮演重要角色。綜上所述，認(rèn)為4種細(xì)胞壁酶在木棗果實生長成熟過程中均有作用，但對于其成熟軟化的機理，還需要更深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉世鵬，龐小亮，曹娟云，等.鮮棗果實中超氧化物歧化酶的測定及含量的分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（15）：36-38.

[2] 雷逢超，鐘? 玉，張有林，等.鮮棗采后生理及貯藏保鮮技術(shù)研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（3）：153-157.

[3] 高秋名.冬棗基因改良的研究[J].綠色科技，2012（1）：90-92.

[4] 田壽樂，周俊義，薛曉敏.冬棗采后主要生理指標(biāo)及與軟化衰老相關(guān)酶活性的研究[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[5] 李宏建，劉? 志，王? 宏，等.PG和LOX酶活性變化與岳帥蘋果果實軟化的關(guān)系研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，27（1）：268-271.

[6] 楊國慧，呂冰玉，韓德果，等.樹莓果實發(fā)育過程中細(xì)胞壁成分及相關(guān)酶活性變化[J].北方園藝，2016（11）：27-30.

[7] 賈艷茹.鴨梨和京白梨果實質(zhì)地變化及其細(xì)胞壁多糖降解特性研究[D].河北秦皇島：河北科技師范學(xué)院，2012.

[8] 黃志明，林素英，傅明連，等.枇杷果實發(fā)育過程中果肉質(zhì)地與胞壁酶活性的變化[J].熱帶作物學(xué)報，2012，33（1）：24-29.

[9] 李? 萍，廖? 康，趙世榮，等.杏果實采后細(xì)胞壁組分及水解酶活性變化研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（6）：446-451.

[10] 羅自生.柿果實采后軟化過程中細(xì)胞壁組分代謝和超微結(jié)構(gòu)的變化[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2005，31（6）：651-656.

[11] 李忠福，徐建國.分光光度法測定果膠酶活性方法的研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2002，15（6）：428-430.

[12] 佟兆國，王? 飛，高志紅，等.果膠降解相關(guān)酶與果實成熟軟化[J].果樹學(xué)報，2011，28（2）：305-312.

[13] 李? 歡，張舒怡，張? 鐘，等.鮮食棗與制干棗的成熟軟化機理差異研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報，2017，32（5）：137-143.

[14] 張進(jìn)獻(xiàn)，李冬杰，李宏杰.果實軟化過程中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組分及細(xì)胞壁酶的變化[J].河北林果研究，2007，22（2）：180-182.

[15] 許? 彬，陳發(fā)河.果實成熟衰老過程中軟化機理研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2011（6）：10-13.

[16] 溫陟良，李志勇，彭士琪，等.贊皇大棗果實成熟期間細(xì)胞壁酶的變化動態(tài)[A].全國干果生產(chǎn)與科研進(jìn)展學(xué)術(shù)研討會[C].北京：中國園藝學(xué)會，1998.

[17] 程杰山，沈火林，井玉芳，等.辣椒果實成熟過程中硬度及相關(guān)生理生化指標(biāo)的變化[J].華北農(nóng)學(xué)報，2006，21（6）：75-78.

[18] 朱丹實，趙麗紅，葛永紅，等.鮮食葡萄采后軟化機制的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2015（3）：389-393.

[19] HADFIELD K A，ROSE J K C，YAVER D S. Polygalacturonase gene expression in ripe melon fruit supports a role for polygalacturonase in ripening-associated pectin disassembly[J].Plant Physiol，1998，117：363-373.