乙草胺對(duì)大鼠肝細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的胞漿鈣離子振蕩的調(diào)控

張彬彬 王玖

摘要：以大鼠肝細(xì)胞為研究對(duì)象，研究乙草胺對(duì)大鼠肝細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)胞漿鈣振蕩的調(diào)控。結(jié)果表明，單獨(dú)乙草胺刺激不引發(fā)胞漿鈣離子振蕩，乙草胺和PE同時(shí)作用對(duì)腎上腺素能受體有抑制作用且具有明顯的量效反應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：乙草胺;腎上腺素能受體;鈣振蕩;肝細(xì)胞

中圖分類號(hào)：Q2;S482? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）16-0104-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.023? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： The effects of different concentrations of acetochlor on the regulation of cytosolic calcium oscillation induced by G protein-coupled receptors in rat hepatocytes was investigated. The results showed that acetochlor and PE could inhibit PE receptors which the effect of acetochlor on it were dose-dependent， and acetochlor alone had no effect on PE receptors.

Key words： acetochlor;adrenergic receptor;calcium oscillations;hepatocytes

乙草胺（Acetochlor）是酰胺類中最具代表性的使用最多的3種除草劑之一[1]。乙草胺原藥在中國(guó)的使用量已超過1×107 kg[2]。乙草胺通過滲透作用或雨水徑流進(jìn)入地下水和地表水，經(jīng)富集作用，對(duì)水生生物或其他生物及人體的生理功能造成一定的損害。楊曉梅等[3]報(bào)道乙草胺對(duì)中華大蟾蜍早期胚胎發(fā)育具有明顯的致畸致死效應(yīng)。謝志浩等[4]發(fā)現(xiàn)乙草胺對(duì)泥鰍血紅細(xì)胞微核及核異常的誘導(dǎo)率顯著提高。生物肝細(xì)胞是最重要的排毒器官，其多種生理功能受到細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)控，受體活性除受到其特異性配體的調(diào)控外，還受其周圍微環(huán)境的影響。肝細(xì)胞多種生理功能受到細(xì)胞表面的G蛋白偶聯(lián)受體（如α1腎上腺素能受體[5]、V1a血管加壓素受體[6]、P2Y嘌呤能受體[7]）的調(diào)控[8]。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，介導(dǎo)了細(xì)胞許多生命活動(dòng)，如細(xì)胞收縮、分泌、運(yùn)動(dòng)等。大鼠肝細(xì)胞為非興奮性細(xì)胞，Woods等[9]最先觀察到苯腎上腺素（Phenylephrine，PE）誘導(dǎo)鼠肝細(xì)胞鈣振蕩，作用于肝細(xì)胞表面的α1腎上腺素能受體而調(diào)控肝細(xì)胞多種生理功能，其功能也受到胞漿鈣的調(diào)控。而乙草胺對(duì)肝細(xì)胞的鈣離子振蕩影響機(jī)制目前尚未開展工作。因此，本試驗(yàn)旨在研究乙草胺對(duì)細(xì)胞鈣離子振蕩的影響機(jī)制，為進(jìn)一步闡明乙草胺作用的分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)動(dòng)物? 大鼠：Sprague-Dawley雄性大鼠（200～400 g），購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物房。

1.1.2? 試劑? 乙草胺購(gòu)于Sigma公司;PE購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

1.2? 方法

1.2.1? 大鼠肝細(xì)胞懸液的制備? 參照Cui等[10]的方法，制備大鼠肝細(xì)胞懸液。每個(gè)灌流槽中加入10 μmol/L Fura-2-AM負(fù)載好的1 mL肝細(xì)胞懸液和1 mL標(biāo)準(zhǔn)液，靜置30 min黏附。在正置熒光顯微鏡下，選擇飽滿、脂膜完整、胞核清晰的細(xì)胞進(jìn)行圈定并測(cè)定。

1.2.2? 乙草胺對(duì)大鼠肝細(xì)胞PE引發(fā)的胞漿鈣離子振蕩的調(diào)控? 用340 nm和380 nm激發(fā)光交替照射細(xì)胞，在510 nm檢測(cè)發(fā)射光，F(xiàn)340 nm/F380 nm比值反映胞漿鈣濃度變化。PE在大鼠肝細(xì)胞可誘導(dǎo)胞漿鈣離子濃度的鈣振蕩性增加，引發(fā)鈣振蕩的PE濃度為1 μmol/L[11]。經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)，確定乙草胺未引起大鼠肝細(xì)胞胞漿鈣振蕩發(fā)生變化的最高濃度和最高肝細(xì)胞全不死的濃度分別為0.1、10 μmol/L。以此濃度范圍為標(biāo)準(zhǔn)，按等比數(shù)列設(shè)計(jì)3個(gè)濃度組（0.1、1、10 μmol/L乙草胺），另設(shè)一對(duì)照組（1 μmol/L PE），每組均至少做3次重復(fù)。試驗(yàn)先用PE刺激15 min，中間用乙草胺作用15 min，然后再用PE刺激15 min。或者連續(xù)用PE刺激45 min，中間加入乙草胺作用15 min，從而檢測(cè)乙草胺對(duì)PE刺激作用的影響。所得數(shù)據(jù)用SigmaPlot軟件作圖，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以熒光比值F340 nm/F380 nm為縱坐標(biāo)。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 乙草胺單獨(dú)刺激對(duì)胞漿鈣振蕩的影響

由圖1可知，PE刺激大鼠肝細(xì)胞后，第一次Ca2+振蕩波峰出現(xiàn)，清洗35 min后，再進(jìn)行PE刺激，第二次Ca2+振蕩波峰出現(xiàn)。細(xì)胞是正常的，并且其受PE刺激后可引發(fā)[Ca2+]振蕩樣升高。細(xì)胞用胞漿Ca2+探針Fura-2AM負(fù)載，激活劑用灌流的方法引入細(xì)胞。其中，PE為1 μmol/L，加入時(shí)間為灌流5 min→PE刺激15 min→清洗35 min→PE刺激15 min→灌流5 min。

圖2為灌流5 min→PE刺激15 min→清洗10 min→乙草胺刺激15 min→清洗10 min→PE刺激15 min→灌流5 min。其中，乙草胺刺激濃度分別為0.1、1、10 μmol/L。結(jié)果表明，當(dāng)PE刺激被清洗掉后，乙草胺不能引發(fā)大鼠肝細(xì)胞鈣振蕩。

2.2? 乙草胺和PE同時(shí)作用對(duì)PE引發(fā)的胞漿鈣振蕩的影響

圖3為灌流5 min→PE刺激45 min→灌流5 min。結(jié)果表明，PE刺激期間，可持續(xù)引起Ca2+振蕩。圖4為PE單獨(dú)刺激15 min后，在繼續(xù)PE刺激的同時(shí)，分別加入0.100、1、10 μmol/L的乙草胺，兩者共同作用細(xì)胞時(shí)間為15 min，然后再PE刺激15 min，最后灌流5 min。結(jié)果表明，當(dāng)乙草胺濃度為0.1 μmol/L時(shí)，由PE引發(fā)的胞漿Ca2+振蕩變化不大;當(dāng)乙草胺濃度為1 μmol/L時(shí)，由PE引發(fā)的胞漿Ca2+振蕩明顯受到抑制;當(dāng)乙草胺濃度為10 μmol/L時(shí)，由PE引發(fā)的胞漿Ca2+振蕩完全受到阻斷。

乙草胺濃度為0.1 μmol/L時(shí)，乙草胺給藥時(shí)和給藥前后比較，對(duì)PE引起的鈣振蕩影響不大。乙草胺的濃度增加到1 μmol/L時(shí)，鈣振蕩影響比較明顯，由給藥前PE在15 min引起鈣峰頻率為9次，減少到PE和乙草胺同時(shí)刺激15 min時(shí)的3次以及乙草胺給藥后PE單獨(dú)刺激的5次。繼續(xù)增加乙草胺濃度到10 μmol/L時(shí)，由PE引起的鈣峰完全被抑制。

3? 小結(jié)與討論

乙草胺本身不能引起鈣峰的出現(xiàn)，乙草胺不能對(duì)未被PE激活的腎上腺素能受體起作用或者其不能結(jié)合到未激活的腎上腺素能受體上;但當(dāng)乙草胺的濃度從0.1 μmol/L增加到1和10 μmol/L時(shí)，乙草胺給藥前和給藥后對(duì)PE引起的鈣振蕩抑制顯著，說明乙草胺可能引起大鼠肝細(xì)胞膜上PE受體數(shù)目減少，也或者乙草胺使得部分受體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而減少了PE與PE受體的結(jié)合而導(dǎo)致鈣峰減少。當(dāng)乙草胺和PE同時(shí)作用于大鼠肝細(xì)胞時(shí)，乙草胺對(duì)大鼠肝細(xì)胞的胞漿鈣振蕩調(diào)控具有抑制影響，尤其是乙草胺的濃度增加到1 μmol/L及以上時(shí)，這種抑制作用更加顯著。本研究揭示了乙草胺對(duì)生物細(xì)胞生理功能影響的作用可能是由于對(duì)受體——激活劑親和力的影響而介導(dǎo)的，推測(cè)可能是乙草胺結(jié)合到已激活的腎上腺素能受體上起作用，也或者是乙草胺阻斷了PE與腎上腺素能受體的結(jié)合。

綜上所述，乙草胺抑制PE介導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞胞漿鈣振蕩，初步探索了乙草胺對(duì)肝細(xì)胞作用的分子機(jī)制，乙草胺對(duì)生物細(xì)胞生理功能的影響和更深層次的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的探討。

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