長順綠殼蛋雞FGF23基因遺傳變異分析

吳磊 羅華倫 張依裕 覃媛鈺 向程舉 吳學樹

摘要：為進一步了解長順綠殼蛋雞FGF23基因的遺傳效應，試驗隨機抽取同日出雛、健康無病、同等管理條件下飼喂10周齡的100只長順綠殼蛋雞，翅靜脈采血，提取DNA，采用混合基因池進行PCR擴增，結合直接測序法對FGF23基因進行單核苷酸多態性（SNP）篩查。結果表明，在長順綠殼蛋雞FGF23基因啟動子區共篩查到3個SNP突變位點（g.73424388，T>C;g.73424577，TC），其中，g.73424388和g.73424660兩個突變位點呈中度多態，g.73424577呈低度多態，說明長順綠殼蛋雞在自然群體中的遺傳多樣性較為豐富。

關鍵詞：長順綠殼蛋雞;FGF23基因;單核苷酸多態性;抗逆性

中圖分類號：S831.2? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）16-0107-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.024? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： To further understand the genetic effects of the FGF23 gene in Changshun green shell，100 random long-green hens fed with 10 weeks old were randomly selected from the same time， healthy and disease-free， under the same management conditions. Blood was collected from the wing veins， DNA was extracted， and PCR was performed using a mixed gene pool. Direct sequencing method was used to study the single nucleotide polymorphism（SNP） screening of FGF23 gene. Results showed that three SNP mutation sites were screened in the promoter region of FGF23 gene in Changshun green shell（g.73424388，T>C;g.73424577，TC） Among them， g.73424388 and g.73424660 two mutation sites are moderate polypeptides， and g.73424577 is a low polypeptide. It showed that the genetic diversity of Changshun green shell hens is abundant in natural populations.

Key words： Changshun green shell hen; FGF23 gene; single nucleotide polymorphism; resistance

成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，FGF），又稱肝素結合生長因子（Heparin binding growth factor），是一類具有廣泛生物學活性的肽類物質，是多能信號分子，具有參與細胞增殖、分化和游走等功能[1]。截至目前，成纖維細胞生長因子共鑒定出23種，包括人類和鼠的FGF（人類FGF15和鼠FGF19尚未被相關研究證實），這23種成纖維細胞生長因子（FGF1～FGF23）均屬于FGF家族成員。成纖維細胞生長因子家族中的這些成員參與調節眾多生長發育過程，特別是在細胞保護、血管再生及促有絲分裂領域已得到開發與應用，根據其系統發育以及同源性的不同，還可以將FGF分為多個亞家族[2]。FGF存在于脊椎動物和無脊椎動物體內，其含有2個內含子和3個外顯子，這是FGF家族因子的典型特征[3]。FGF23由成骨細胞等腎外組織合成和分泌，對機體內很多腺體及器官，如胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺及心臟、肝臟等都有作用[4]。本研究通過篩查長順綠殼蛋雞FGF23基因啟動子區多態性、計算其等位基因頻率和PIC并進行分析等工作，結合FGF23及其基因多態性在人體內對骨骼發育、血磷穩定等的影響，從而推測其在家禽體內的作用，為進一步了解家禽機體血磷穩定、保障家禽機體健康、家禽選種育種提供參考，對促進家禽業的良好發展具有重要的意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗動物? 長順綠殼蛋雞隨機采樣于貴州大學動物科學學院農場（100只：♂50，♀50），采樣方法為翅靜脈采血，每只采血1.0～1.5 mL，保存于普通生化管內（無抗凝劑條件下）靜置斜放，用移液槍把析出的血清轉移到離心管內離心直至樣品清澈透亮，樣品放置于-20 ℃保存備用。

1.1.2? 主要試劑? 全血DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司;2×Taq PCR Master Mix試劑和瓊脂糖購自北京康為世紀生物科技有限公司;DM2000 購自重慶擎科生物科技有限公司。

1.1.3? 主要儀器? 電泳儀（DYY-2C），北京市六一儀器廠;化學發光熒光全自動分析成像儀（Biosens SC710），上海山富科學儀器有限公司;梯度PCR儀（PTC200），美國Bio-Rad公司;電子天平（BL-320H），日本津島公司;高壓滅菌鍋（HRLM-80），中國海爾集團。

1.2? 方法

1.2.1? 基因組DNA的提取? 全血基因組DNA的提取方法，參照天根生化科技（北京）有限公司生產的血液/組織/細胞基因組提取試劑盒（DP304）內所附的操作說明書，在實際操作中可以根據具體情況稍作修改（如適當延長離心次數和離心時間、適當增加或減少操作步驟中試劑的用量），但要保證所提DNA的質量。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，NANODROP 2000 DNA濃度測定儀（美國Thermo Scientific公司）測定濃度。

1.2.2? 引物合成及目的片段擴增? 根據雞基因mRNA序列（GenBank登錄號：NC_006088.4）設計1對引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系：1 μL基因組DNA模板，上游引物和下游引物各1 μL，10 μL 2×Es Taq Master Mix，7 μL RNase-Free Water，總體積為20 μL，反應程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環;72 ℃延伸5 min。待反應結束后，將PCR反應產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.2.3? SNP篩查和統計分析? 利用相關的生物信息學分析軟件，如DNA STAR、MW snap等對FGF23基因測序結果進行SNP篩查，尋找突變位點并計算等位基因頻率。參照李萬貴等[5]、潘蘭兵[6]的方法，運用DNA STAR等生物軟件進行序列拼接、比對、篩查多態位點;統計各等位基因頻率、基因型頻率。利用SPSS軟件處理分析，并計算位點純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數（Ne）、多態信息含量（PIC）等。

2? 結果與分析

2.1? 基因組DNA提取檢測結果

按照試劑盒內操作提取3個雞品種所有個體的全血基因組DNA，其完整性通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。由圖1可以看出，所提的DNA完整性較好，經熒光全自動分析成像儀及DNA濃度檢測儀檢測。結果表明，OD260 nm/OD280 nm的比值為1.8～2.0，DNA純度較高，可用于下一步試驗。

將提取所得的DNA進行PCR擴增，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得結果如圖2所示。由圖2可知，經過PCR擴增所獲得的目標片段呈現單一、明亮的條帶，且PCR擴增產物與預期片段大小相符，檢測結果顯示PCR擴增產物可用于下一步試驗研究。

2.2? FGF23基因SNP（單核苷酸多態性）篩查

通過DNA混合池結合直接測序的方法，運用DNA STAR等軟件進行分析后，在雞FGF23基因的啟動子（73424155～73425413）區域共檢測到3個SNP位點。每個突變位點上的堿基突變為第g.73424388位堿基發生（T>C）突變、第g.73424577位堿基發生（T

2.3? FGF23基因啟動子區SNP部分遺傳特性分析

通過對3個SNP位點進行分析統計后所得出的結果見表2。由表2可知，長順綠殼蛋雞FGF23基因啟動子區g.73424388位點上發生T/C突變，等位基因頻率分別為0.443和0.567，位點雜合度（He）為0.491，雜合性較高;多態信息含量（PIC）為0.370 4，屬于中度多態;在g.73424577位點發生T/C突變，等位基因頻率分別為0.950和0.050，位點雜合度（He）為0.095，雜合性較低;PIC為0.090 5，屬于低度多態;在g.73424660位點發生C/G突變，等位基因頻率分別為0.443和0.567，位點雜合度（He）為0.491;PIC為0.370 4，屬于中度多態。3個突變位點有效等位基因數（Ne）分別為1.965、1.105和1.965，群體分布較均勻。

3? 討論

目前，有關FGF23基因在家禽方面的研究報道十分少見，對于FGF23及其基因的絕大部分研究為其與人體的機體發育、新陳代謝、人類健康和疾病之間的相關性[5]，也有一些該基因在實驗動物（如鼠）體內進行相關研究的文獻和報道。本研究以長順綠殼蛋雞為試驗材料，首次在FGF23基因啟動73424155～73425413區域共檢測到3個SNPs位點，第g.73424388位堿基發生（T>C）突變、第g.73424577位堿基發生（T

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