黑節(jié)鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術研究

封海東 金善忠 張斌 周明 張澤志 趙志全 郭銳

摘要：對黑節(jié)鐵皮石斛莖尖原球莖誘導和莖尖增殖以及小苗生根進行了初步研究。采用黑節(jié)鐵皮石斛無菌苗莖尖，經(jīng)過75%乙醇消毒30 s后，去除表皮，黑節(jié)鐵皮石斛帶節(jié)莖尖原球莖誘導與莖尖增殖最佳培養(yǎng)基為1/2MS+5.5 g/L瓊脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭。黑節(jié)鐵皮石斛生根最佳培養(yǎng)基為1/2MS+5.5g/L瓊脂+0.15 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L香蕉泥+20 g/L白砂糖+0.25 g/L活性炭。

關鍵詞：黑節(jié)鐵皮石斛;莖尖;原球莖;增殖;生根

中圖分類號：Q813.1? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）16-0139-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.032? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The protocorm induction and proliferation as well as seedling rooting of Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. cv. Heijie stem tip were studied preliminarily. Dendrobium candidum Wall. ex Lindl. cv. Heijie stem tip was sterilized with 75% alcohol for 30 s， and then the epidermis was removed. The best protocorm induction and proliferation medium of Dendrobium candidum Wall. exLindl. cv. Heijie stem tip was 1/2 MS+5.5 g/L agar+0.55 mg/L 6-Benzylaminopurine+0.55 mg/L 1-Naphthalenea acid+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L mashed potato+20 g/L white granulated sugar+0.45 g/L activated carbon. The best rooting medium of Dendrobium candidum Wall. exLindl. cv. Heijie seedling was 1/2 MS+5.5 g/L agar+0.15 mg/L 6-Benzylaminopurine+0.55 mg/L 1-Naphthalenea acid+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L banana puree+20 g/L white granulated sugar+0.25 g/L activated carbon.

Key words： Dendrobium candidum Wall. Ex Lindl. cv. Heijie; stem tip; protocorm; proliferation; rooting

鐵皮石斛（Dendrobium candidum Wall. Ex Lindl. cv. Heijie）為蘭科石斛屬多年生草本藥用植物，是一種傳統(tǒng)名貴中藥材，始載于《神農(nóng)草經(jīng)》，具有滋陰清熱、益胃生津、提高免疫力、抗癌防癌等作用。鐵皮石斛種子必須在適宜的環(huán)境與真菌共生才能萌發(fā)，且種子與莖段扦插繁殖成本高、用量大、周期長，難以形成規(guī)模化。組織培養(yǎng)技術是實現(xiàn)快速繁殖、規(guī)模化生產(chǎn)的最佳方法。

近年來，相關研究學者開展了大量的鐵皮石斛原球莖誘導、叢生芽增殖和生根組織培養(yǎng)快繁技術研究。蘇鈦等[1]研究表明，以莖段為外植體在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+馬鈴薯汁10%+白砂糖3%，具有很好的原球莖誘導作用，50 d后誘導率達95.20%。戴傳云等[2]用正交試驗篩選出鐵皮石斛原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L KT。張桂芳等[3]認為一定濃度的BA、KT和NAA有利于原球莖的增殖，KT濃度為1.0 mg/L時，原球莖40 d增殖倍數(shù)最高，達9.0。郭洪波等[4]通過無菌莖段實現(xiàn)鐵皮石斛快速繁殖，且外植體在MS+5.0 mg/L 6-BA+NAA（0～0.8 mg/L）上誘導叢生芽最好，誘導率高達93.33%，增殖培養(yǎng)基為MS+5.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+20%香蕉泥。陳兆貴等[5]也表明，1/2MS+2.0 mg/L IBA+水解酪蛋白500 mg/L+10%香蕉提取液的培養(yǎng)基上效果較好，45 d生根率達92%。不同培養(yǎng)基、生長調節(jié)劑的使用，對不同外植體原球莖誘導、叢生芽、生根有不同影響。如，王春等[6]用鐵皮石斛的莖尖作為外植體，接種1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基上誘導產(chǎn)生原球莖，誘導率為58%。常美花等[7]研究結果表明，鐵皮石斛帶芽莖段原球莖誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.0 g/L瓊脂;而不加生長調節(jié)劑的MS培養(yǎng)基鐵皮石斛的原球莖誘導率為0。

另外，組織培養(yǎng)技術的應用，導致鐵皮石斛引種、野轉家栽培、組培苗人工栽發(fā)生混亂，同一產(chǎn)區(qū)的鐵皮石斛品種繁多，同一鐵皮石斛品種的品質也存在較大差異[8]。十堰地區(qū)鐵皮石斛品種較多，但少有利用組織培養(yǎng)技術工廠化生產(chǎn)鐵皮石斛，多采用野轉家、引種的方式進行人工栽培，導致十堰地區(qū)鐵皮石斛規(guī)模化生產(chǎn)成本高、投入大。黑節(jié)鐵皮石斛，又稱紅稈軟腳鐵皮石斛，是由野生鐵皮石斛培育的新品種，藥效成分優(yōu)于野生鐵皮石斛[9]，又易制成楓斗，從而引起人們的關注。鑒于此，以黑節(jié)鐵皮石斛莖尖為材料，對其叢生芽誘導和生根進行了初步研究，以期為十堰地區(qū)黑節(jié)鐵皮石斛的人工繁殖技術研究作鋪墊。

1? 材料與方法

1.1? 材料

試驗材料：黑節(jié)鐵皮石斛莖尖來源于丹江口市鹽池河中藥材專業(yè)合作社提供。

設備：諸城鼎力機械有限公司全自動高壓殺菌鍋（制造許可證編號TS2237502-2016，設備代碼217037502201）;KC-280灌裝機控制器（溫州市凱馳包裝機械有限公司）;SW-CJ-ID單人凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

試劑：以1/2MS為基本培養(yǎng)基，生長調節(jié)劑選用6-BA（6-benzylaminopurine）和NAA（1-naphthlcetic acid），外源添加物為土豆泥（去皮、切塊，加水煮爛，過濾，取濾汁）、香蕉泥、瓊脂粉（福建省石獅市高新瓊脂食品有限公司閩南瓊膠有限公司），pH為5.5～5.7。

1.2? 方法

1.2.1? 培養(yǎng)基的配制? 原球莖誘導培養(yǎng)基：①1/2MS+5.5 g/L瓊脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭;②MS+2 mg/L 2，4-D+30 g/L白砂糖;叢生芽誘導培養(yǎng)基：①1/2MS+5.5 g/L瓊脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭;②1/2MS+5.5 g/L瓊脂+0.55 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭;生根培養(yǎng)基：1/2MS+5.5 g/L瓊脂+0.15 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L香蕉泥+20 g/L白砂糖+0.25 g/L活性炭。上述培養(yǎng)基配置好后，分別裝入培養(yǎng)瓶中，重復次數(shù)50瓶。置于高壓殺菌鍋中滅菌30 min（121 ℃，0.1 MPa）。放入培養(yǎng)室2 d，在沒有細菌和真菌污染的培養(yǎng)瓶內(nèi)接種黑節(jié)鐵皮石斛。

1.2.2? 莖段選取與處理? 從丹江口市鹽池河中藥材專業(yè)合作社簡易大棚種植基地采取生長旺盛黑節(jié)鐵皮石斛植株，用洗潔精清洗15 min，再用自來水反復沖洗數(shù)次，擦干備用。將組培苗瓶子外部用75%乙醇擦拭干凈后，置于凈化工作臺上，備用。

2017年10月對黑節(jié)鐵皮石斛進行不同的處理（第一種：75%乙醇對大棚種植的黑節(jié)鐵皮石斛消毒30 s;第二種：75%乙醇對無菌組培的黑節(jié)鐵皮石斛消毒30 s;第三種：對無菌組培的黑節(jié)鐵皮石斛不消毒）后，留取幼嫩莖尖，并剪成帶節(jié)間的長2.0 cm的莖段，叢生芽誘導培養(yǎng)基內(nèi)培育30 d。2018年6月，對黑節(jié)鐵皮石斛無菌苗莖段進行原球莖、叢生芽、生根誘導。

1.2.3? 培養(yǎng)條件? 將接種后的培養(yǎng)瓶均放入光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為（25±2） ℃，光照10 h/d，光照度為1 500～2 000 lx，濕度為60%～70%。每天觀察黑節(jié)鐵皮石斛帶芽莖段在培養(yǎng)基中的生長情況，篩選出原球莖與叢生芽誘導最佳培養(yǎng)方式。

2? 結果與分析

2.1? 黑節(jié)鐵皮石斛帶節(jié)莖段消毒方法的篩選

由表1可知，黑節(jié)鐵皮石斛帶節(jié)莖尖僅用75%乙醇消毒處理1 min后，污染率較高。而組培無菌苗經(jīng)過70%乙醇消毒處理1 min后，污染率較低（表1）。這與李丹等[9]研究結果一致。因此，進行鐵皮石斛組培時，采用無菌苗進行，或用75%乙醇消毒有菌苗后，再用0.1%HgCl2處理莖段20 min。

2.2? 黑節(jié)鐵皮石斛莖尖的原球莖誘導

常美花等[7]通過MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2 g/L瓊脂誘導鐵皮石斛莖段，誘導率達到34.98%。蘇鈦等[1]的研究也表明，鐵皮石斛莖段在培養(yǎng)基MS+2.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+馬鈴薯汁10%+3%白砂糖上，原球莖誘導率達95.20%。本研究通過無菌鐵皮石斛莖尖進行快速繁殖，發(fā)現(xiàn)1/2MS+5.5 g/L瓊脂+0.55 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L土豆泥+20 g/L白砂糖+0.45 g/L活性炭，具有較好的原球莖誘導作用，速度快、效果好（表2、圖1）。這說明由于鐵皮石斛原球莖在MS培養(yǎng)基上，采用一定濃度的6-BA和NAA均能夠有效促進鐵皮石斛莖尖的原球莖誘導。

2.3? 黑節(jié)鐵皮石斛莖尖增殖

增殖是鐵皮石斛腋芽生長與地上生物量增加較多的過程。王春等[6]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA能夠較好誘導鐵皮石斛不定芽生長。而本試驗結果顯示，在相同培養(yǎng)基條件下，6-BA和NAA濃度的不同，對黑節(jié)鐵皮石斛莖尖增殖有明顯的差異，且NAA的用量直接影響小苗增殖效果（表3、 圖2）。鄧瑞云等[10]通過不同NAA濃度的培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA導致鐵皮石斛小苗矮粗，發(fā)生變異現(xiàn)象。這可能是培養(yǎng)基中生長調節(jié)劑濃度的不平衡，導致鐵皮石斛生長隨著生長調節(jié)劑濃度的變化，而有一定的趨向性。

2.4? 黑節(jié)鐵皮石斛小苗生根的培養(yǎng)

挑選3 cm高的小苗接種于生根培養(yǎng)基中60 d后，培養(yǎng)基1/2MS+5.5 g/L瓊脂+0.15 mg/L 6-BA+0.55 mg/L NAA+0.1 mg/L AgNO3+100 g/L香蕉泥+20 g/L白砂糖+0.25 g/L活性炭，能夠有效促進鐵皮石斛小苗生根（圖3）。這與鄧瑞云等[10]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的NAA培養(yǎng)基對鐵皮石斛小苗生根無顯著影響，而香蕉泥對鐵皮石斛根系有明顯的促進作用結果一致。

3? 討論

隨著人們生活改善及醫(yī)療保健意識提高，鐵皮石斛的需求持續(xù)增加，野生資源已經(jīng)不能滿足需求，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是解決供求矛盾的良好途徑。實施產(chǎn)業(yè)化的人工栽培首要任務就是解決種源的問題，但鐵皮石斛的自然繁殖率低，僅僅依靠自然繁殖無法滿足產(chǎn)業(yè)化的需求，因此科學繁育種苗是發(fā)展的必然選擇。本研究使用黑節(jié)鐵皮石斛無菌苗進行快速繁殖，縮短了組培育苗的時間，且小苗質量較好。在組織培養(yǎng)中，原球莖及外植體的增殖與外源植物生長調節(jié)劑的作用密不可分，其中適當濃度配比的6-BA和NAA尤為重要。在鐵皮石斛生根培養(yǎng)上，香蕉汁對根系有一定的促進作用。

參考文獻：

[1] 蘇? 鈦，張曉南.液體懸浮培養(yǎng)促進鐵皮石斛原球莖高效誘導、增殖的研究[J].中國野生植物資源，2009，28（4）：54-56.

[2] 戴傳云，劉騰飛，管天冰，等.鐵皮石斛原球莖增殖培養(yǎng)基配方的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（10）：5788-5789.

[3] 張桂芳，關杰敏，黃? 松，等.鐵皮石斛原球莖的誘導與增殖影響因素研究[J].中藥材，2011，34（8）：1172-1177.

[4] 郭洪波，于曉丹，陳麗靜，等.鐵皮石斛莖節(jié)離體培養(yǎng)的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2007（11）：2659-2660.

[5] 陳兆貴，譚? 俊.不同激素配比對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響研究[J].惠州學院學報（自然科學版），2006（3）：11-14.

[6] 王? 春，鄭勇平，羅? 蔓，等.鐵皮石斛試管苗快繁體系[J].浙江林學院學報，2007（3）：372-376.

[7] 常美花，金亞征，王? 莉.鐵皮石斛快繁技術體系研究[J].中草藥，2012，43（7）：1412-1417.

[8] 方建華，范傳潁，陳華進，等.鐵皮石斛不同產(chǎn)地的品質比較[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2017，58（10）：1755-1756.

[9] 李? 丹，王馨彩，尹明華.黑節(jié)鐵皮石斛原球莖誘導、再分化以及腋芽萌發(fā)和生根的初步研究[J].上饒師范學院學報，2010，30（6）：73-78.

[10] 鄧瑞云，羅煥明，劉曉津，等.鐵皮石斛組培快繁技術研究[J].廣東藥學院學報，2013，29（6）：608-611.