氣道上皮hCLCA1與肺內源性ARDS炎癥及預后相關性的初步研究

張天相 梁家寧 楊揆 鄭龍 陳偉 張艷 宋立強

空軍軍醫大學西京醫院呼吸與危重癥醫學科,西安710032

肺內源性急性呼吸窘迫綜合征(pulmonary acute respiratory distress syndrome,ARDSp)是ARDS的最常見臨床類型,是指由直接影響肺實質的病變如肺炎、淹溺、毒氣、肺挫傷等誘發的ARDS,其中最常見的病因是感染[1]。目前認為發病機制是感染相關啟動因子誘導以中性粒細胞為主的炎癥細胞在肺內大量積聚、浸潤,過度釋放、活化炎癥因子,而抗炎因子相對減少,引發肺部炎癥反應失衡[2]。其中支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中中性粒細胞百分比和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平是反映炎癥程度的常用監測指標[3-4]。但ARDSp病死率仍居高不下的主要原因是炎癥的啟動機制仍未能完全闡明。

氣道上皮細胞是呼吸系統的第一道物理屏障,也是具有生物學活性的免疫屏障,對外界刺激能迅速做出功能性反應甚或結構性改變。近年研究發現氣道杯狀細胞分泌的人鈣激活氯離子通道1(human calcium-activated chloride channel 1,hCLCA1)蛋白與COPD、支氣管哮喘等氣道疾病的黏液高分泌及炎癥機制緊密相關[5-6]。但是氣道上皮杯狀細胞及h CLCA1在ARDSp發病機制中扮演怎樣的角色仍不清楚。基于此,本觀察性臨床研究擬探討h CLCA1表達水平與ARDSp患者肺部炎癥水平、臨床預后的相關性,試圖找到hCLCA1在ARDSp病理生理中發生變化的線索。

1 對象與方法

1.1研究對象 2017年1月至2018年6月空軍軍醫大學西京醫院呼吸內科門診及病房需要行支氣管鏡檢查的患者作為研究篩選對象,根據納入標準分別收入ARDSp組、社區性獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)組及正常對照組。研究方案得到醫院醫學倫理委員會批準,檢測標本得到入選患者的知情同意。

1.1.1ARDSp組納入標準 (1)入住呼吸重癥監護室并且未超過48 h；(2)符合ARDS柏林指南診斷標準[7],病因系CAP；(3)排除COPD、哮喘、支氣管擴張等慢性氣道基礎疾病、血液疾病及長期吸煙史,近1周無使用全身皮質激素史；(4)臨床診療過程已經決定擬行支氣管鏡檢查及灌洗獲取下呼吸道標本；(5)年齡≥18歲；(6)根據臨床特征排除單純性重癥CAP[8]。

1.1.2CAP組納入標準 (1)已經預約氣管鏡檢查的門診患者；(2)符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南(2016年版)》診斷標準[9]；(3)病程未超過1周；(4)排除COPD、哮喘、支氣管擴張等慢性氣道基礎疾病、血液疾病及長期吸煙史,近1周無使用全身皮質激素史；(5)年齡≥18歲；(6)未達到重癥肺炎診斷標準。

1.1.3正常對照組納入標準 (1)已經預約氣管鏡檢查的門診患者；(2)臨床診斷為孤立性肺部結節或包塊性質待查；(3)排除COPD、哮喘、支氣管擴張等慢性氣道基礎疾病、血液疾病及長期吸煙史,近1周無使用全身皮質激素史；(4)年齡≥18歲；(5)同意在正常肺葉獲取BALF。

1.2方法

1.2.1BALF標本采集 根據ARDSp組和CAP組患者的影像學滲出性病灶、正常對照組患者的正常肺葉確定灌洗的靶位。經支氣管鏡工作通道注入37℃無菌生理鹽水20 ml。注入完成后,抽吸灌洗液,回收率40%～60%為合格,經雙層紗布過濾,收集至無菌容器置于含冰塊的保溫箱里,立即送往實驗室檢查。

1.2.2BALF細胞計數 在4℃、1 200 r/min、離心半徑8.4 cm條件下離心10 min,上清液放置于-80℃冰箱保存備用。沉淀的細胞用Hank's液(不含Ca2+、Ma2+)再離心沖洗2次,每次5 min。棄去上清后加Hank's液3～5 ml制成細胞懸液。在Neubauer計數臺上計數BALF中細胞總數。如果細胞數過高時,再用Hank's液稀釋,調整細胞數為5×109/L,并同時將試管浸入碎冰塊中備用。計數方法：采用細胞離心涂片裝置,加入備用細胞懸液(細胞濃度為5×109/L)100μl,在4℃、1 200 r/min、離心半徑8.4 cm條件下離心1 min,通過離心作用將一定數量的BALF細胞直接平鋪于載玻片上。取下載玻片立即用冷風吹干,置于無水乙醇中固定30 min后進行瑞吉式染色。在40倍光學顯微鏡下計數200個細胞,進行細胞分類計數并計算中性粒細胞占細胞總數百分比。

1.2.3BALF蛋白含量檢測 取上述離心后獲取的BALF上清液,常溫下解凍,使用多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司),采用酶聯免疫吸附試驗法檢測TNF-α(由武漢博士德公司提供)及hCLCA1(由英國Abcam公司提供)水平。具體操作步驟如下：(1)從室溫平衡20 min后的鋁箔袋中取出所需板條；(2)設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品100μl；(3)樣本孔先加待測樣本10μl,再加樣本稀釋液40μl,空白孔不加；(4)除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μl,用封板膜封住反應孔,37℃恒溫箱溫育90 min；(5)棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復5次；(6)每孔加入底物A、B各50μl,37℃避光孵育15 min；(7)每孔加入終止液50μl,在450 nm波長處測定各孔的OD值。以標準品的吸光度值繪制標準曲線,推導回歸方程,計算各組BALF中hCLCA1、TNF-α的水平。

1.3統計學分析 應用SPSS 17.0統計學軟件進行統計學處理。計量資料以±s表示,處理組間分析采用配對t檢驗。指標間的相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義,P＜0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1一般資料 ARDSp組26例,其中男15例,女11例,年齡(59.3±6.7)歲。以28 d內是否死亡為標準分為2個亞組：生存組14例,其中男8例,女6例,年齡(57.2±7.8)歲；死亡組12例,其中男7例,女5例,年齡(61.2±3.2)歲。生存組和死亡組的入院基線臨床指標分別是氧合指數[(142.5±20.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)、(133.6±15.5)mm Hg]、APACHEⅡ評分[(17.3±3.1)分、 (18.4±7.2)分]、SOFA評分[(6.5±1.4)分、(7.2±2.5)分],組間比較差異無統計學意義。CAP組26例,其中男16例,女10例,年齡(53.84±14.60)歲。正常對照組28例,其中男16例,女12例,年齡(50.03±15.3)歲。3組性別、年齡差異無統計學意義,基礎情況具有均衡性。

2.2各組BALF中h CLCA1、TNF-α水平及中性粒細胞百分比的比較 與正常對照組比較,ARDSp組、CAP組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細胞百分比均顯著升高(P值均＜0.01)。ARDSp組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細胞百分比高于CAP組(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

表1 3組患者BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒細胞百分比的比較(±s)

表1 3組患者BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒細胞百分比的比較(±s)

注：BALF為支氣管肺泡灌洗液；hCLCA1為人鈣激活氯離子通道1；TNF-α為腫瘤壞死因子α；CAP為社區性獲得性肺炎；ARDSp為肺內源性急性呼吸窘迫綜合征；與正常對照組比較,a P＜0.01；與CAP組比較,b P＜0.05,c P＜0.01

組別 例數 hCLCA1(ng/L)TNF-α(ng/L)中性粒細胞百分比(%)正常對照組 28 5.03±1.55 5.52±1.64 1.32±0.98 CAP組 26 22.35±11.85a 52.58±28.81a 43.25±16.15a ARDSp組 26 50.01±20.72ab 80.73±25.91ab 74.37±10.13ac

2.3不同預后ARDSp患者治療前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒細胞百分比的比較 治療前,ARDSp死亡組BALF中hCLCA1、TNF-α均高于生存組(P值分別為0.035、＜0.01),2組BALF中中性粒細胞百分比差異無統計學意義。

與治療前比較,ARDSp死亡組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細胞百分比在治療7 d后差異無統計學意義,ARDSp生存組BALF中hCLCA1、TNF-α、中性粒細胞百分比在治療7 d后下降(P值均＜0.05)。見表2。

表2 不同預后ARDSp患者治療前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒細胞百分比的比較(±s)

表2 不同預后ARDSp患者治療前后BALF中hCLCA1、TNF-α及中性粒細胞百分比的比較(±s)

注：ARDSp為肺內源性急性呼吸窘迫綜合征；BALF為支氣管肺泡灌洗液；hCLCA1為人鈣激活氯離子通道1；TNF-α為腫瘤壞死因子α

組別 例數 hCLCA1(ng/L)TNF-α(ng/L)中性粒細胞百分比(%)治療前 治療7 d后 P值治療前 治療7 d后 P值治療前 治療7 d后 P值生存組 14 38.12±16.27 27.05±12.75 0.043 60.82±18.47 44.79±18.70 0.034 72.64±6.89 64.35±11.92 0.039死亡組 12 52.29±17.46 63.79±12.45 0.081 96.33±21.17 106.91±12.09 0.150 76.38±12.61 72.91±17.68 0.610 P值 0.035 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.490 0.170

2.4ARDSp患者BALF中各項指標的相關性直線相關分析顯示,ARDSp患者BALF中hCLCA1與TNF-α呈正相關(r=0.823,P＜0.05),BALF中中性粒細胞百分比與TNF-α呈正相關(r=0.417,P＜0.05),同時與hCLCA1也呈正相關(r=0.430,P＜0.05)。

3 討論

全身及肺部炎癥風暴目前仍被公認為是ADRS的主要發病機制。包括肺炎在內的多種肺內外病因能誘發過度活化的炎癥反應發生,其中肺內中性粒細胞、肺泡巨噬細胞等炎癥細胞的激活以及大量炎性介質、細胞因子的釋放被認為是ARDS的特征性炎癥標志。但是這種炎癥風暴的始動機制仍不清楚,以至于在ARDS發生后臨床只能被動地給予支持對癥處理,而且針對炎癥本身采取的糖皮質激素、一氧化氮、西維來司他、他汀等治療方案在臨床研究中均未能獲得預期療效,“積極等待”炎癥水平回落成為臨床的無奈事實。

炎癥細胞數量及炎癥介質水平仍然是臨床評判炎癥程度的直接指標。TNF-α作為促炎分子之一,其可以促進中性粒細胞的吞噬能力,促進中性粒細胞脫顆粒和釋放溶酶體,增強中性粒細胞呼吸暴發,產生大量脂質代謝產物,引起微血管舒縮異常和微血栓形成,加速ARDS的發展進程。Kim等[10]研究認為ARDS患者氣道中中性粒細胞的水平與疾病嚴重程度呈正相關,在氣道炎癥中發揮著重要作用。另有研究認為,TNF-α是ARDS發生炎癥介質“瀑布”樣反應的始動因子,可以刺激其他細胞因子和炎癥因子的生成和釋放,形成逐級放大的連鎖反應,進一步損傷血管內皮細胞,增加其通透性,導致白細胞黏附、中性粒細胞脫顆粒并趨化到炎癥損傷部位,加重肺部損傷,在ARDS的發生中發揮著極為重要的作用[11]。本課題組曾使用內毒素誘導建立ARDS小鼠模型,得出ARDS小鼠BALF中TNF-α含量明顯高于正常小鼠的結果[12]。然而針對TNF-α的單抗沒能在臨床研究中改善預后,可見復雜的炎癥網絡機制在ARDS發生中共同發揮著作用。此外,Abraham等[13]提出BALF中中性粒細胞百分比可以很直觀反映急性肺損傷的嚴重程度的觀點,驗證了肺損傷程度與肺泡內中性粒細胞的數量呈正相關。本研究結果發現ARDSp患者BALF中的TNF-α水平均明顯高于CAP患者及正常對照組；ARDSp生存組TNF-α水平低于死亡組,同時治療7 d后該組的TNF-α水平較治療前下降。提示了TNF-α是肺組織炎癥水平的重要標識因子之一。此研究中ARDSp患者BALF中中性粒細胞百分比與TNF-α呈正相關,ARDSp生存組在治療7 d后BALF中中性粒細胞百分比也較治療前下降,此結果再一次驗證了TNF-α及中性粒細胞在ARDSp嚴重程度評價中的意義。

氣道上皮細胞是否參與ARDS肺部炎癥風暴的形成仍不清楚。防治ARDS的關鍵環節仍然是闡明其炎癥的始動機制,位于氣道第一屏障的上皮細胞是否在ARDSp發生中扮演一定的始動作用呢?本研究擬初步探討既往未知的氣道上皮杯狀細胞及相關蛋白在ARDSp發生、發展中的角色。氣道杯狀細胞特有的hCLCA1最初被認為是一種跨膜蛋白,目前確認hCLCA1是分泌型蛋白,裂解的N端肽段對上皮細胞Cl-通道具有調節作用,能調控黏液蛋白的合成[14],其與氣道慢性炎癥(包括哮喘、COPD和肺囊性纖維化等)的發生與程度密切相關[15-19]。有研究表明,hCLCA1與肺部感染性炎癥的形成相關。如Hauber等[20]使用內毒素可以直接誘導培養人氣道黏液細胞分泌hCLCA1。2014年Dietert等[21]報道mCLCA3-/-小鼠金黃色葡萄球菌肺炎模型BALF中趨化因子CXCL1及IL-17減少,并降低了肺部中性粒細胞的浸潤程度。以上結果初步證實了氣道上皮合成的CLCA參與了肺部感染性炎癥的形成并可能扮演促進作用,而其與ARDS之間的關系正是本研究設計時關注的要點。本研究結果顯示ARDSp患者BALF中的hCLCA1高于CAP患者及正常對照組。ARDSp死亡組BALF中hCLCA1高于生存組,經過治療未能下降,而生存組則有所降低。通過直線相關性分析得出hCLCA1與TNF-α水平呈正相關,這種相關性提示兩者在ARDSp病理生理改變中可能存在一定因果關系。

總之,本研究以ARDSp為主要目標人群,以BALF中hCLCA1水平為主要目標指標,通過對ARDSp、CAP及正常肺葉人群BALF中hCLCA1、TNF-α水平及中性粒細胞百分比的變化、相關性以及與預后轉歸的關系分析,初步提示氣道上皮hCLCA1與ARDSp的肺組織炎癥水平及預后可能存在一定正相關性,推測CLCA可能對ARDS炎癥機制具有促進作用,需要在動物及細胞實驗中進一步證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突