黃連解毒湯調控apoE-/-小鼠粒細胞釋放中性粒細胞捕捉網的研究*

孫慧娟，朱镠孌，張 玥，陳 冰，薛 欣，曾 輝，馬雅鑾△

(1. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700； 2. 首都醫科大學附屬北京地壇醫院傳染病研究所，北京 100015； 3. 新發突發傳染病研究北京市重點實驗室，北京 100015)

高脂血癥(hyperlipidemia, HP)可引起機體慢性炎癥[1]，導致動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)的發生發展。在這一過程中，單核細胞與其分化生成的巨噬細胞發揮了重要作用[2]。前期研究發現，黃連解毒湯干預可以降低高脂導致的炎癥型單核細胞，減輕全身和血管局部炎癥反應，最終抑制高脂飲食喂飼的apoE-/-小鼠AS斑塊形成[3-4]。

在高脂血癥引發AS發生發展的過程中，除單核細胞和巨噬細胞之外，其他免疫細胞也參與AS相關的炎癥反應[5]。粒細胞是成人外周血比例最高的白細胞，也是天然免疫系統的第一道防線。但由于中性粒細胞主要功能是清除病原體和壞死組織，此類細胞在AS這種無菌性疾病中的作用并未引起足夠重視。近期研究發現，中性粒細胞活化后，其胞內DNA、組蛋白和多種酶形成復合物，被主動釋放到胞外，形成中性粒細胞胞外捕捉網(neutrophil extracellular traps, NETs)[6]。NETs可以能夠捕獲和殺滅病原體，同時也可以引起組織炎癥損傷[6]。研究發現，NETs含量與AS嚴重程度相關[7]。

本研究關注apoE-/-小鼠外周血中粒細胞、淋巴細胞及中性粒細胞/淋巴細胞(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)變化以及粒細胞釋放NETs水平，探討黃連解毒湯能否改善高脂所致的NLR和NETs變化，減輕高脂造成的粒細胞活化，進一步揭示黃連解毒湯對高脂血癥/AS的免疫調節機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性8周齡C57BL/6及apoE-/-小鼠，體質量(20±2)g，所有實驗用鼠均購于北京大學實驗動物中心(動物許可證號SCXK(京)2016-0010)，實驗干預小鼠飼養于北京大學實驗動物中心，SPF條件。

1.2 藥物

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶2∶2∶3比例組成，飲片購于北京同仁堂藥店，藥材均經鑒定，按常規方法煎煮取汁，濃縮成相當于黃連解毒湯生藥0.5 g/mL。阿托伐他汀20 mg/片(批號S36972)，美國輝瑞制藥有限公司生產。

1.3 試劑及儀器

TC、TG、LDL-C和HDL-C試劑盒，日本和光公司；Quan-iT PicoGreenTMdsDNA 檢測試劑盒，美國Thermo公司；FACS Callibur流式細胞儀，美國BD公司；自動酶聯免疫系統，美國Thermo公司；Beckman CX4全自動生化分析儀，美國貝克曼·庫爾特公司。

1.4 動物分組及干預方法

實驗動物分5組，每組10只小鼠。C57BL/6+普食為對照組(C57BL/6+CD)；apoE-/-小鼠采用配對比較法隨機分為apoE-/-+普食組(apoE-/-+CD)、apoE-/-+高脂組(apoE-/-+WD)、apoE-/-+高脂+黃連解毒湯組(apoE-/-+WD+HLJDT)、apoE-/-+高脂+阿托伐他汀組(apoE-/-+WD+Atr)。高脂飼料含78.85%基礎飼料，0.15%膽固醇，21%脂肪。干預組小鼠根據體質量每天給予臨床等效劑量(阿托伐他汀[3 mg/(kg·d)]、黃連解毒湯[5 g/(kg·d)])，其他小組采用等量純凈水灌胃。每周檢測體質量變化，分別干預4周和18周。

1.5 檢測指標及方法

干預4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠異戊烷吸入麻醉，小鼠摘眼球采EDTA抗凝血，離心(800×g, 10 min)后取血漿，用于血脂和NETs檢測；血細胞用于流式細胞儀檢測。干預18周的C57BL/6及apoE-/-小鼠剝離胸腹主動脈，用于病理檢測。

1.5.1 血脂水平測定 干預4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠血漿采用過氧化酶法測定血漿膽固醇(cholesterol，TC)；脂肪酶/甘油磷酸酯氧化酶-過氧物酶比色法測定甘油三酯(triglyceride，TG)；直接法測定低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)。

1.5.2 外周血粒細胞及淋巴細胞比例檢測 干預4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠的血細胞加入獲取血漿等量PBS，裂解紅細胞后應用FACS Callibur流式細胞儀(美國BD公司)檢測。根據前向散射角和側向散射角分出粒細胞和淋巴細胞。

1.5.3 NETs cfDNA檢測 干預4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠血漿采用PicoGreen 法定量檢測血漿中NETs cfDNA的含量。

1.5.4 病理染色 干預18周的C57BL/6及apoE-/-小鼠，剝離胸腹主動脈，用4%多聚甲醛固定， 20%蔗糖脫水，經油紅O染色、分化后觀察。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 血脂水平比較

表1顯示，黃連解毒湯和阿托伐他汀干預后對高脂喂飼的apoE-/-模型小鼠血脂影響。與既往研究一致，黃連解毒湯干預后TC、TG、HDL和LDL的水平均未見顯著改變(P>0.05)。

表1 各組動物血脂水平比較

注：與野生普食組比較：**P<0.001； 與apoE-/-高脂組比較：#P<0.05，##P<0.001

2.2 外周血粒細胞、淋巴細胞比例及NLR的變化

表2顯示，與野生小鼠比較，普通飲食喂飼的apoE-/-小鼠外周血粒細胞比例顯著升高，淋巴細胞比例降低，NLR升高(P<0.05)。4周高脂飲食后，apoE-/-模型小鼠外周血粒細胞比例進一步升高，淋巴細胞比例進一步降低，NLR顯著升高(P<0.05)。黃連解毒湯和阿托伐他汀干預apoE-/-小鼠粒細胞降低，淋巴細胞比例升高，差異無統計學意義(P>0.05)，但NLR明顯降低(P<0.05)。

表2 各組動物外周血粒細胞、淋巴細胞比例及

注：與野生普食組比較：*P<0.05，**P<0.001；與apoE-/-高脂組比較：#P<0.05，##P<0.001

2.3 血漿NETs cf DNA含量比較

表3顯示，NETs DNA可在血液中成為細胞游離DNA(cell free DNA，cfDNA)[8]。結果發現，與正常對照小鼠和普食apoE-/-小鼠比較，高脂飲食的apoE-/-小鼠血漿cfDNA水平顯著增高(P<0.001)。經4周干預，黃連解毒湯顯著下調cfDNA水平(P<0.05)，阿托伐他汀無明顯影響cfDNA水平(P>0.05)。

表3 各組動物血漿cfDNA 水平比較

注：與野生普食組比較：*P<0.05，**P<0.001；與apoE-/-高脂組比較：#P<0.05，##P<0.001

2.4 動物主動脈斑塊形成情況

圖1顯示，飼養18周的apoE-/-普食組主動脈弓和主動脈干可見不規則零散粥樣硬化斑塊，高脂喂飼apoE-/-主動脈干斑塊數量增多，面積增大，主動脈弓可見大片斑塊；黃連解毒湯和阿托伐他汀干預后，主動脈血管斑塊面積顯著減小。

圖1 油紅O染色檢測主動脈病理組織變化

3 討論

長期高血脂引發機體免疫異常、系統性炎癥反應，包括多種免疫細胞的數量和功能失常，炎癥介質過量產生，導致脂質清除障礙，促進AS形成發展[2,5]。單核/巨噬細胞既是天然免疫細胞，又是血管AS斑塊主要的組成細胞，在AS中起重要作用，受到極大關注[2]。黃連解毒湯出自《肘后備急方》，是清熱解毒的經典代表方。近年越來越多臨床與研究證明，黃連解毒湯對于高血脂導致的AS有治療作用[3-4,9]。

中性粒細胞因其壽命短暫、更新迅速、表型不穩定、無特異性標記等，在AS病變過程中的作用一直未引起重視[10]。隨著近年來粒細胞表型精準確定，粒細胞在AS中的作用逐漸受到重視。高脂血癥及冠心病患者中性粒細胞數量增多[11]，活化的中性粒細胞釋放NETs含量與冠心病的嚴重程度相關[7]。中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)升高會增加AS的患病率[12]。研究發現，中性粒細胞通過多種機制參與AS的病變[13-14]。首先，粒細胞是黏附于血管內皮的首發和主要白細胞，通過呼吸爆發產生細胞毒性和氧化活性，引發氧化應激和組織進行性損傷，導致內皮功能障礙和血管炎癥，直接影響血管AS形成[15]。其次，NETs激活pDCs分泌IFN-a，擴大炎癥促進AS斑塊面積增大，增加斑塊破裂的風險[16]。第三，粒細胞不僅引發炎癥反應，還通過分泌炎性細胞因子募集活化單核細胞等其他免疫細胞，放大炎癥反應，參與AS斑塊的形成[17]。

本研究發現，與野生小鼠比較，apoE-/-小鼠外周血中粒細胞數目上升雖然沒有顯著差異，但NLR已經顯著升高，提示造血系統向生成粒細胞傾斜。同時，盡管難以直接檢測AS中的NETs，但考慮到高脂血癥可以引發系統性炎癥，因此檢測NETs釋放至血液中的cfDNA，發現高脂飲食apoE-/-小鼠血漿cf DNA顯著增多，提示高脂導致NETs的大量生成[16]。前期研究已經發現，黃連解毒湯干預降低高脂引發apoE-/-小鼠外周血單核細胞及其炎癥亞型比例[3-4]。本研究中，黃連解毒湯雖然沒有顯著降低高脂引發的粒細胞比例，但顯著降低NLR，減少血漿cfDNA 即NETs含量。因此，黃連解毒湯還可能通過調節控制粒細胞功能，糾正NETs和NLR，抑制和延緩AS形成。在研究干預4周和18周內，未檢測到血脂水平明顯改善，可見黃連解毒湯的免疫調節作用不依賴于其降脂作用。

綜上所述，本研究發現黃連解毒湯干預可以通過調控粒細胞免疫，抑制炎癥反應，降低高脂引發的免疫損傷，抑制AS斑塊形成。

由于粒細胞是AS炎癥反應的始發細胞，且人體粒細胞占循環白細胞比例與小鼠粒細胞比例有很大差異，我們檢測到小鼠粒細胞只占循環白細胞10%～15%，而人體循環中粒細胞比例高達50%～70%[14]。由此推測，粒細胞的異常在人體免疫及AS中的作用應該更為顯著。因此本研究認為，調控失常的粒細胞，對預防和治療AS有很好的前景。