積芎解毒方對糖尿病腎病大鼠腎組織NF-кB、AngⅡ表達的影響*

王 崢，李建鵬，張 翥，彭貴軍

(1. 河南中醫藥大學第一附屬醫院,鄭州 450000； 2. 河南省中醫院,鄭州 450002)

糖尿病腎病的發生發展是多因素綜合作用的結果，病理改變主要有腎小球高濾過、腎小球基底膜增厚、微量白蛋白尿濾出、腎功能下降至終末期腎衰竭，其確切發病機制至今尚未闡明。隨著學者們對炎癥因素在糖尿病腎病發生發展中作用機制的認識，以及抗炎治療在動物模型中取得成功的例子，阻斷免疫炎癥將可能成為治療糖尿病腎病的新手段。本研究通過觀察復方積雪草顆粒積芎解毒方對糖腎大鼠模型腎組織炎癥因子含量水平的影響，探討對糖腎大鼠的腎保護作用及可能機制，以期為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級健康雄性 SD 大鼠 60 只，體質量(200±20)g，由河南省動物實驗中心提供(動物許可證號SCXK(豫)2010-0002)。

1.2 藥物與試劑

積芎解毒方中藥顆粒劑(由積雪草、川芎、黃芪組成，江蘇江陰天江藥業有限公司生產，批號1607090)；福辛普利片(上海中美施貴寶公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；總蛋白、白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、24 h尿蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔多克隆抗體NF-κB(美國abcam公司)；兔多克隆抗體AngⅡ(美國abcam公司)；羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；蛋白分子量標準Marker(美國Sigma公司)；RNA 提取試劑盒(北京天根生物有限公司)；反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；SYBR Green 定量PCR 試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3 動物分組、造模及給藥方法

60只大鼠隨機選取10 只為正常對照組，普通飼料喂養，余大鼠給予高糖高脂飼料喂養，給予 2% 鏈脲菌素(STZ) 60 mg·kg-1的劑量一次性腹腔注射，正常對照組則注射等量的枸櫞酸緩沖液。大鼠自由飲水進食 72 h 后，尾靜脈全血血糖≥ 16.7 mmol·L-1作為糖尿病模型造模成功的標準。正常喂養4周后 24 h尿蛋白定量(UTP) ≥30 mg 者判定糖尿病腎病大鼠造模成功，納入實驗。造模成功大鼠隨機分為模型對照組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、福辛普利組各10只。

根據陳奇主編《中藥藥理學研究方法》，將積芎解毒方中藥顆粒(黃芪30 g,川芎20 g,積雪草30 g)用三蒸水溶解配制成高濃度生藥0.5 g/ml，中濃度生藥0.25 g/ml，低濃度生藥0.125 g/ml，按2 ml/100 g·d-1劑量分別給予高、中、低中藥劑量組大鼠灌飼，福辛普利組給予福辛普利 0.167 mg /100 g·d-1灌飼，正常對照組與模型對照組大鼠每日予生理鹽水2 ml/100 g·d-1劑量灌飼，連續給藥8 周。第8周末代謝籠收集24 h尿液，后處死大鼠取血；取腎皮質0.2 g，制成勻漿液保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 生化指標檢測

大鼠的血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶 (AST)、24 h尿蛋白定量(UTP)等采用自動生化分析儀測定。

1.5 Real time PCR技術檢測各組腎組織核因子Kappa B(NF-кB)、血管緊張素-Ⅱ(AngⅡ)mRNA 的表達

取腎皮質，采用Trizol法提取總RNA進行RNA 的濃度測定，然后經反轉錄合成cDNA進行PCR 反應。PCR 反應條件: 95 ℃ 30 s， 95 ℃ 5 s， 60℃30 s，擴增50 個循環。以β-actin 為內參，采用△△Ct 法進行相對定量分析，以2-△△Ct作為目的RNA 的相對表達量。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設計提供，引物序列: β-actin引物上游：5'-AGG CCG GCT TCG CGGGCG AC-3'，下游：5'-CAG GGG AGC CACACG CAG CTC-3'，擴增判斷243 bp；NF-кB引物上游：5'-TCAGACACCTTTGCACTTGG-3'，下游：5'-GATAAGGAGTGCTGCCTTGC-3'，擴增判斷187 bp；AngⅡ引物上游：5'-GCCAGATACTGCGAAAGCATGA -3'，下游：5'-GCTTCCATTCGCACCACAGA -3'，擴增判斷186 bp。

1.6 Western Blot技術檢測各組腎組織NF-кB、AngⅡ蛋白的表達

腎組織勻漿離心后去上清液，采用BCA法測定蛋白定量，處理后的蛋白樣品SDS-PAGE凝膠上電泳，并轉移至PVDF轉印膜，以標準蛋白Marker為參照，依分子量大小切取條帶，5%脫脂奶粉封閉。一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育，化學發光試劑顯色，用掃描儀掃描特異性蛋白條帶。利用Image J 圖像分析系統讀取內參β-actin及目的蛋白條帶的平均灰度值，目的蛋白灰度值與內參灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠生化指標比較

表1顯示，與模型對照組比較，各治療組UTP明顯下降，TP、ALB 均明顯升高，其中中藥高劑量組優于低劑量組(P<0.01)，與福辛普利組相似(P>0.05)，中藥中劑量組與低劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，中劑量組與高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，各組ALT、AST變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠生化指標比較

注：與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01; 與中藥高劑量組比較:△P<0.05.

2.2 各組大鼠腎組織NF-KB、AngⅡ表達比較

圖1 各組NF-KB、AngⅡ蛋白免疫印跡條帶圖

表2圖1顯示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠腎組織NF-кB KB、AngⅡ mRNA水平及蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與模型對照組比較，各治療組NF-кB、AngⅡ mRNA水平及蛋白表達均明顯降低，其中中藥高劑量組優于低劑量組(P<0.01)，與福辛普利組相似(P>0.05)，中藥中劑量組與低劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，中劑量組與高劑量組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組腎組織NF-кB、AngⅡ mRNA、蛋白表達比較

注：與模型對照組比較:*P<0.05,**P<0.01; 與中藥高劑量組比較:△P<0.05

3 討論

中醫古籍雖未見糖尿病腎病這一疾病名稱，但從其臨床表現及發展機制來看，屬于中醫“消渴”“水腫”等范疇。中醫認為，稟賦不足、飲食不節、勞欲過度、情志失調為糖尿病腎病的病因。其病理機制關鍵是本虛標實，本虛為氣血、陰陽、五臟之虛，標實為水濕、瘀血、痰濁等病理產物。中醫藥在糖尿病腎病的治療中已積累了較豐富的經驗，特別是在延緩糖尿病腎病病程進展，提高生存質量等方面具有一定的優勢[1]。有資料表明，中醫藥在治療糖尿病腎病有一定療效，且能減緩西藥副作用，延緩終末期腎臟病的發生，但仍有不足。如治療方案多樣化、不統一、小樣本觀察病例研究為多，可比性、重復性差，缺乏循證醫學多中心大樣本協作研究，藥物作用機理研究少等。因此借助現代生物學技術，加強基礎研究，篩選有效的中藥制劑是防治糖尿病腎病的重要目標。本研究小組依據各家[2-3]及前期臨床經驗研究[4-5]，總結本病以氣虛瘀毒為主要病機特點，在疾病的不同發展階段，病機的側重點也不盡相同，總屬本虛標實，確立“益氣活血解毒”作為各期的基本治法，選用多年臨床總結的積芎解毒方作為基礎治療方案。其組方為黃芪、川芎、積雪草，以黃芪益氣健脾補腎治療糖尿病腎病之本虛；以川芎活血祛瘀通絡，積雪草清熱利濕、解毒消腫治療糖尿病腎病之標實?，F代藥理研究證實，黃芪對腎小球基底膜電荷屏障和機械屏障均有保護作用[6]，從而減輕通透性蛋白尿，并可改善局部血流動力學異常，減輕或延緩腎功能進展。川芎可用于機體免疫調控，改善高凝狀態，減輕腎小球病理損害，降低慢性腎衰竭大鼠腎組織中TGF-β1的表達,延緩慢性腎衰竭的進展[7]。積雪草可抑制肌成纖維細胞的增生、聚集，抑制腎小管上皮細胞中TGF-β1的表達，減輕腎小管間質的損傷，發揮抗腎纖維化作用[8-9]。

糖尿病腎病被認為是一種炎癥性疾病[10-11]，目前發現的糖尿病腎病炎癥信號傳導通路主要有MAPK信號傳導通路、TLR信號傳導、NF-kB抑制物激酶(IKK)/NF-kB信號通路等，通過各種炎癥因子如NF-кB、AngⅡ、TGF-β1、MCP-1等在這些通路中起主要介導作用，參與龐大復雜的免疫炎癥反應過程[12-14]，最終引起不同程度的腎臟損害。NF-кB在細胞因子網絡調節中發揮轉錄調控作用，糖尿病狀態下葡萄糖自身氧化、蛋白非酶糖基化終末產物生成、多元醇途徑活性增強等均可導致NF-кB激活、堆積，NF-кB活化后能誘導許多炎癥因子的轉錄，誘導蛋白尿增加、腎小球硬化及小管間質纖維化[15]。AngⅡ不僅是一種血管活性因子，與高糖具有協同效應，還作為一種炎癥因子，通過與靶細胞表面的特異性受體結合，使靶細胞核內轉錄因子的活性改變，通過激活NF-кB促進MCP-1的合成，參與腎臟組織中單核細胞的募集反應，介導腎組織的炎癥反應，是影響慢性腎臟病預后的重要環節之一[16]。

本實驗結果顯示，糖尿病腎病模型對照組大鼠腎組織內炎癥因子NF-кB、AngⅡmRNA和蛋白的表達水平明顯高于正常組，表明糖尿病腎病時炎癥信號傳導通路的激活以及各種細胞因子的介導，調節著糖尿病腎病進展中炎癥反應過程。積芎解毒方高劑量組可下調糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥因子的表達，具有降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白、提高血清蛋白的作用，與福辛普利組作用相似，且沒有明顯的肝損。提示積芎解毒方對糖尿病腎病大鼠的腎保護作用，可能與抑制炎癥信號傳導通路的激活、降低免疫炎癥反應、從而延緩腎功能進展有關，但其具體作用機制還需進一步探討。