膨化酶解法提取鹿花盤(pán)膠原蛋白及特性研究

趙雅洲

研究背景

鹿花盤(pán)是梅花鹿或馬鹿鋸茸后，在鹿角基部留下的茸角骨化后，在下一個(gè)生茸期開(kāi)始時(shí)脫落的部分。鹿花盤(pán)是我國(guó)一種傳統(tǒng)名貴的中藥，具有抗炎作用，用于治療乳腺炎、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。在實(shí)際臨床應(yīng)用中常將鹿花盤(pán)熬制成鹿角膠。然而，由于鹿花盤(pán)異常堅(jiān)硬，熬制鹿角膠費(fèi)時(shí)費(fèi)力，資料顯示其提取率只有17%。本課題主要研究如何提高鹿花盤(pán)的提取率，以提高其利用率。

鹿花盤(pán)中主要的有效成分是蛋白質(zhì)。食品加工技術(shù)中經(jīng)過(guò)膨化可以使玉米蛋白質(zhì)得到降解，使蛋白質(zhì)熟化變性利于吸收。膨化過(guò)程中，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展、二硫鍵等次級(jí)鍵部分?jǐn)嗔?，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由原來(lái)緊密有序的結(jié)構(gòu)變成了松散無(wú)規(guī)則的構(gòu)象，易被水解，從而使蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)特性得以改善，提取率顯著提高。因此，物理方法在提高提取率方面有很好的效果，如果將膨化和酶解法相結(jié)合，理論上會(huì)使大分子物質(zhì)斷裂得更為充分，更能增加水溶的概率。

因此，我想對(duì)鹿花盤(pán)提取方法進(jìn)行改進(jìn)，將鹿花盤(pán)膨化后，使用酶裂解的方法提取鹿花盤(pán)提取物，獲得較高的提取率。最關(guān)鍵的部分是對(duì)提取物的特性進(jìn)行研究，以驗(yàn)證提取效果，為鹿花盤(pán)的深加工建立新方法。

研究過(guò)程

膨化條件的優(yōu)化

將鹿花盤(pán)用中藥粉碎機(jī)粉碎后磨成細(xì)粉，分別過(guò)100目和300目篩子，制備成100目細(xì)粉和300目超微粉。分別稱(chēng)取等量鹿花盤(pán)塊、100目鹿花盤(pán)粉、300目超微粉，使用單螺桿膨化機(jī)膨化，測(cè)定膨化樣品的直徑。以徑向膨化率表示膨化度（徑向膨化率一平均直徑/?？字睆剑⑼ㄟ^(guò)體視學(xué)顯微鏡測(cè)定未膨化和膨化鹿花盤(pán)粉的顯微結(jié)構(gòu)。本研究主要考查3個(gè)因素對(duì)鹿花盤(pán)膨化度的影響：溫度、含水量、壓強(qiáng)。

結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)條件下最適宜的物料粒度為100目;根據(jù)不同溫度、模頭壓強(qiáng)和物料含水量對(duì)鹿花盤(pán)膨化度的單因素影響，在本實(shí)驗(yàn)條件下最適宜的膨化溫度為120℃、模頭壓強(qiáng)為4Mpa、物料含水量為25%。在這一條件下，經(jīng)過(guò)水提法提取膨化鹿花盤(pán)粉（PP）有效成分提取率為30.23%，較未膨化鹿花盤(pán)粉（AP）的提取率提高了9.56%。

鹿花盤(pán)的酶解條件優(yōu)化

選取胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶4種蛋白酶對(duì)AP和PP進(jìn)行酶解，對(duì)單酶篩選中提取率最高的蛋白酶進(jìn)行單因素條件優(yōu)化。

PP對(duì)4種單酶的酶解提取率均高于AP。且在膨化和未膨化鹿花盤(pán)粉中，胃蛋白酶酶解鹿花盤(pán)的提取率最高，中性蛋白酶酶解的提取率最低。由此選擇胃蛋白酶作為膨化鹿花盤(pán)單酶解和正交實(shí)驗(yàn)中的主要酶。隨著料液比的增加，提取率持續(xù)增長(zhǎng)且越來(lái)越平緩;當(dāng)加酶量達(dá)到4%時(shí)，提取率最高，而后呈下降趨勢(shì);隨著酶解時(shí)間的加長(zhǎng)，提取率逐漸升高，考慮實(shí)際生產(chǎn)利用率等問(wèn)題，選擇2h、4h和6h作為酶解時(shí)間范圍。

根據(jù)胃蛋白酶單因素條件摸索的范圍，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到胃蛋白酶單因素提取范圍：料液比1：30，酶解4h，加酶量4%，酶解溫度37℃。利用最佳酶解條件對(duì)PP進(jìn)行酶解，最終提取率達(dá)到36.39%。

鹿花盤(pán)膠原蛋白的特性研究

◇抗氧化活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)

鹿花盤(pán)在治療乳腺增生、抗疲勞、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面的功效顯著，而這些疾病常常與人體產(chǎn)生的自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)密切相關(guān)，清除自由基也被廣泛認(rèn)為可延緩人體衰老和預(yù)防疾病。因此，通過(guò)對(duì)不同提取方法的鹿花盤(pán)提取物進(jìn)行體外抗氧化活性的測(cè)定，可以全面地了解和掌握鹿花盤(pán)抗氧化特性。

分別取AP的提取液（AB）、PP的提取液（PB）和膨化的鹿花盤(pán)酶解提取液（MB）作為樣品，利用三氯化鐵還原法和DPPH清除自由基法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取方法不同，3種鹿花盤(pán)提取物抗氧化能力略有不同，但均具有良好的抗氧化特性，其中膨化酶解后鹿花盤(pán)提取物抗氧化能力最強(qiáng)，膨化鹿花盤(pán)水提取物次之，未處理鹿花盤(pán)水提取物最弱。這說(shuō)明鹿花盤(pán)的抗氧化活性可以隨著提取方法的深入而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且隨著提取物濃度的增大，總還原力和DPPH自由基清除能力增強(qiáng)。

抗炎活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

鹿花盤(pán)具有顯著的抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)利用鹿花盤(pán)提取物對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥模型進(jìn)行作用。對(duì)比不同提取條件下的鹿花盤(pán)提取物對(duì)炎癥細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，不同的鹿花盤(pán)提取物能有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。其抗炎作用可能與釋放NO、TNF-a、IL-1B和IL-6有關(guān)，且PB對(duì)抑制3種促炎細(xì)胞因子的效果更加顯著。

線蟲(chóng)模型效果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)利用線蟲(chóng)，對(duì)不同方法處理后的鹿花盤(pán)提取物進(jìn)行抗衰老、抗疲勞方面的效果驗(yàn)證，為后期相關(guān)鹿花盤(pán)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論和數(shù)據(jù)支持。

·對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響：本實(shí)驗(yàn)中我們選定的不同提取方式的鹿花盤(pán)提取物給藥濃度均為1mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照白藜蘆醇濃度為100uM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AB組對(duì)線蟲(chóng)壽命沒(méi)有顯著影響，PB組和MB組均能明顯延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命，且MB組的作用效果稍強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照白藜蘆醇。

·對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)的影響：實(shí)驗(yàn)第1～6天，各組線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)形式均為A型，第10天開(kāi)始有所不同，給藥組A型線蟲(chóng)均多于對(duì)照組。從第14天和第18天的結(jié)果可以看出給藥組線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)明顯好于對(duì)照組，且PB和MB組線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)好于AB組。

·對(duì)線蟲(chóng)吞咽頻率的影響：在線蟲(chóng)生命初期（第1～5天），給藥組和對(duì)照組的吞咽頻率無(wú)明顯差異，第9～17天觀察結(jié)束，給藥組與對(duì)照組有顯著差異（P<0.05）。說(shuō)明不同處理方式的鹿花盤(pán)提取物均能不同程度地增強(qiáng)線蟲(chóng)的吞咽頻率，提高晚期線蟲(chóng)生存狀態(tài)，且PB和MB組效果好于AB組。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鹿花盤(pán)提取物能明顯延長(zhǎng)野生型線蟲(chóng)的壽命，提高線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，在線蟲(chóng)生存晚期效果更加明顯，鹿花盤(pán)提取物給藥組A、B型線蟲(chóng)數(shù)目明顯多于對(duì)照組。鹿花盤(pán)提取物能提高線蟲(chóng)吞咽頻率，增強(qiáng)咽部吞咽能力，具有明顯抗衰老、抗疲勞的作用，且鹿花盤(pán)膨化處理及酶解處理后效果更顯著。

總結(jié)

本次研究創(chuàng)造性地將物理和生物化學(xué)方法相結(jié)合，設(shè)計(jì)了一套高效的鹿花盤(pán)提取方法，并對(duì)該方法的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行條件摸索和優(yōu)化，通過(guò)離體模型（體外實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞模型）和活體模型對(duì)鹿花盤(pán)提取物抗氧化、抗炎、延緩衰老和抗疲勞等功效進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)通過(guò)粉碎、膨化、酶解后的鹿花盤(pán)提取物的效果明顯好于傳統(tǒng)提取方法。

◇通過(guò)粉碎、膨化、酶解3個(gè)步驟，將鹿花盤(pán)膠原蛋白的提取時(shí)間縮短到1天之內(nèi)，提取率提高到了36.39%，相比鹿角塊水煮的提取率提高了將近1倍，相比熬制鹿角膠耗時(shí)4～7天，藥典記載的17%的提取率提高了1倍多。

◇確定了鹿花盤(pán)膨化的最佳提取粒度為100目，最佳膨化條件為膨化溫度120℃、模頭壓強(qiáng)4Mpa、物料含水量25%。

◇最佳酶解提取方法為：使用胃蛋白酶酶解，料液比1：30，酶解4h，加酶量4%，酶解溫度37℃。

◇分別通過(guò)離體、細(xì)胞和活體3種生物模型，遞進(jìn)式地對(duì)膨化酶解后的鹿花盤(pán)膠原蛋白特性進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)抗氧化特性提高了25%;同時(shí)顯著提高了抑制炎性巨噬細(xì)胞釋放NO的能力，且顯著提高了抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng);顯著延長(zhǎng)野生型線蟲(chóng)的壽命，提高線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和抗疲勞的能力。

該項(xiàng)目獲得第33屆全國(guó)青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競(jìng)賽項(xiàng)目中學(xué)組生物醫(yī)學(xué)組一等獎(jiǎng)。

專(zhuān)家評(píng)語(yǔ)

本研究實(shí)用性強(qiáng)、思路清晰、設(shè)計(jì)合理，改裝了裝置，設(shè)計(jì)了提取流程和優(yōu)化條件，提高了提取率。建議進(jìn)一步細(xì)化提取流程。