眼科粘彈劑中硫酸軟骨素含量的測定

黃慧娟 喬玉潔 吳劍英

摘 要 目的：建立眼科粘彈劑中硫酸軟骨素含量的測定方法，并進行方法學(xué)驗證。方法：采用醋酸鈉和氯化十六烷基吡啶將樣品中的硫酸軟骨素沉淀，用氯化鈉溶液溶解后采用咔唑法測定硫酸軟骨素的含量。結(jié)果：方法學(xué)驗證結(jié)果表明，線性范圍為30.07～150.34 μg/ml，r為0.999 5；準(zhǔn)確度試驗的9組樣品平均回收率為101.40%，RSD（n=9）為0.96%；精密度試驗中，12份含量測試的平均值為102.1%，RSD（n=12）為1.22%；耐用性試驗中，改變條件測得的結(jié)果與正常條件下測得的含量之比為99.9%～101.4%。結(jié)論：本研究的方法線性良好，準(zhǔn)確度、精密度和耐用性均符合標(biāo)準(zhǔn)，可用于眼科粘彈劑中硫酸軟骨素含量的檢測。

關(guān)鍵詞 眼科粘彈劑 硫酸軟骨素 含量

中圖分類號：R988.1； R927.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）15-0113-03

Determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device

HUANG Huijuan1*， QIAO Yujie2， WU Jianying2**

（1. Shanghai Jianhua Fine Biological Products Co.， Ltd.， Shanghai 200231， China； 2. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 200052， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device and to conduct methodological validation. Methods： The chondroitin sulfate in the sample was precipitated by sodium acetate and cetylpyridinium chloride， and then precipitate was dissolved in sodium chloride solution and the content of chondroitin sulfate was determined by carbazole method. Results： This method had good specificity with a linear range at 30.07-150.34 mg/ml and correlation coefficient （r） 0.999 5. The average recovery of the 9 groups of samples for accuracy test was 101.40% with RSD （n=9） 0.96%. The average value of 12 parts of samples for precision test was 102.1% with RSD （n=12） 1.22%. The ratio of the content determined under the changed condition to the content determined under normal conditions is 99.9% to 101.4% in the durability test. Conclusion： The method established in this study can be used for the determination of chondroitin sulfate content in ophthalmic viscosurgical device since its linearity， accuracy， precision and durability are in line with standards.

KEy WORDS ophthalmic viscosurgical device； chondroitin sulfate； content

白內(nèi)障是一種常見的眼科疾病，目前無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家白內(nèi)障致盲性均位居首位。在白內(nèi)障手術(shù)中，眼科粘彈劑是常見的手術(shù)輔助材料之一，目前國內(nèi)產(chǎn)品中眼科粘彈劑的主要成分大多為透明質(zhì)酸鈉，屬于內(nèi)聚性粘彈劑[1-3]。雖然內(nèi)聚性粘彈劑能維持良好的手術(shù)空間，但是高黏滯性和強黏彈性對手術(shù)操作過程和眼內(nèi)環(huán)境造成影響，易導(dǎo)致角膜內(nèi)皮細胞的損傷。硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸鈉混合制備的彌散性眼科粘彈劑則能夠很好地貼覆于眼組織表面，從而更好地保護角膜內(nèi)皮細胞不受損傷[4-5]。透明質(zhì)酸鈉和硫酸軟骨素均為酸性黏多糖，結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)相似，因此當(dāng)兩者共存于制劑中時，其含量測定會相互干擾。《中華人民共和國藥典》2015年版二部采用HPLC法測定硫酸軟骨素含量，但是由于樣品中含有的透明質(zhì)酸鈉是大分子高黏度的化合物，不適合進色譜柱。本研究首先用醋酸鈉調(diào)節(jié)樣品的pH，加入適量氯化十六烷基吡啶（CPC）選擇性地沉淀硫酸軟骨素，而透明質(zhì)酸鈉不被沉淀，從而將兩者有效分離，并參考《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0308-2015醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠》中“透明質(zhì)酸鈉含量測定方法（咔唑法）”測定硫酸軟骨素含量，并進行方法學(xué)驗證。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器

Evoiution 260Bio紫外可見分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；MS105DU分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

眼科粘彈劑（含透明質(zhì)酸鈉和硫酸軟骨素，上海建華精細生物制品有限公司自制，批號：180523，180530，180610）；硫酸軟骨素鈉（純度99.5%，中國食品藥品檢定研究院，批號：140792-201702）；氯化十六烷基吡啶（化學(xué)純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；無水醋酸鈉（特優(yōu)級，上海泰坦科技股份有限公司）；其余測試用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取眼科粘彈劑樣品適量，精密稱定，加蒸餾水稀釋至每1 ml溶液中含硫酸軟骨素1 mg，即得樣品溶液。精密量取樣品溶液10 ml置小燒杯中，加入醋酸鈉1.6 g，攪拌，使醋酸鈉溶解后，精密加入0.8%的氯化十六烷基吡啶溶液10 ml，充分攪拌，靜置2 h，用5 μm微孔濾膜通過抽濾濾過，過濾2次，將濾餅置小燒杯內(nèi)，加1.4 mol/L氯化鈉溶液約30 ml，超聲處理，將溶液定量轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，重復(fù)處理3次，稀釋至刻度，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取硫酸軟骨素對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加1.4 mol/L氯化鈉溶液溶解至刻度，搖勻，制成每1 ml含150 μg硫酸軟骨素，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 測定法

精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ml、0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml分別置于25 ml具塞試管中，依次分別加1.4 mol/L氯化鈉溶液至1.0 ml，混勻置于冰水浴中，分別緩慢加入0.025 mol/L四硼酸鈉硫酸溶液5.0 ml，邊加邊搖勻，密塞，沸水浴加熱15 min（中間振搖1次），迅速冷卻，加0.125%咔唑-無水乙醇溶液0.2 ml，搖勻，沸水浴加熱15 min（中間振搖1次），冷卻至室溫。以不加標(biāo)準(zhǔn)溶液管為空白對照在530 nm波長處測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/ml）為x軸，其相應(yīng)的吸光度值為y軸作直線回歸，求得直線回歸方程。精密量取供試品溶液1 ml，置25 ml具塞試管中，自“冰水浴中冷卻”起，同法操作。由直線回歸方程計算硫酸軟骨素的濃度，并按樣品標(biāo)示濃度40 mg/ml計算樣品中硫酸軟骨素的含量。

2 方法學(xué)驗證

2.1 線性

按1.3.2項下制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3項下求得直線回歸方程，得到線性方程為y=0.005 5x+ 0.017，r為0.999 5，符合r≥0.990的要求，線性良好，含量可測定范圍為30.07～150.34 μg/ml。

2.2 準(zhǔn)確度

取已知含量的硫酸軟骨素對照品適量，精密稱定，加入按產(chǎn)品處方比例配制不含硫酸軟骨素的溶液，使得硫酸軟骨素的濃度分別為0.8 mg/ml，1.0 mg/ml和1.2 mg/ml，按1.3.1項中“精密量取樣品溶液10 ml置小燒杯中”起同法操作制備供試品溶液，每個濃度平行配制3份，按1.3.3項測定法測定硫酸軟骨素的含量，并計算回收率（表1）。

2.3 精密度

兩位研究員分別按1.3.1項下同時制備6份供試品溶液，按1.3.3項測定法測定硫酸軟骨素的含量，分別計算6組樣品檢測結(jié)果平均值和RSD值，并比較兩位研究員的檢測結(jié)果（表2）。

2.4 耐用性

在其他測定條件不變的情況下，測定方法發(fā)生微小變動，考察該方法的耐用性。調(diào)整水解時間至方法規(guī)定的±2 min，調(diào)整最大吸收波長至方法規(guī)定的±2 nm，并作隨行線性，測定硫酸軟骨素的含量（表3）。改變條件測得的結(jié)果與正常條件下測得的含量之比在99.9%～101.4%之間，均符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 樣品含量的檢測

采用該方法檢測3批自制樣品，批號為180523、 180530、180610的眼科粘彈劑硫酸軟骨素含量分別為101.6%、102.1%、101.3%。

3 討論

本研究通過參考文獻資料[6-10]，建立了咔唑法檢測眼科粘彈劑中硫酸軟骨素含量的方法，選用醋酸鈉和氯化十六烷基吡啶使硫酸軟骨素沉淀，得到的濾餅采用氯化鈉溶液完全溶解后進行測定，對照品采用硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品。方法學(xué)驗證結(jié)果表明，該方法線性良好，準(zhǔn)確度、精密度和耐用性試驗結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)。采用該方法檢測3批次自制樣品，硫酸軟骨素含量均符合標(biāo)準(zhǔn)。本研究試驗方法穩(wěn)定，能準(zhǔn)確檢測樣品中的硫酸軟骨素含量，可用于眼科粘彈劑產(chǎn)品硫酸軟骨素含量的測定。

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