一種腸鏡潤滑消泡劑的細胞毒性和遺傳毒性生物學評價

黃虹蓉 林鐘石 劉堯 鐘文雨

摘要：目的? 對一種以二甲基硅油、甘油、羧甲基纖維素鈉為成分的腸鏡潤滑消泡劑進行細胞毒性和遺傳毒性評價，為這種腸鏡潤滑消泡劑在臨床使用提供生物安全依據。方法? 選擇瓊脂擴散試驗對腸鏡潤滑消泡劑進行體外細胞毒性檢測，選擇細菌回復突變試驗（Ames試驗）、用小鼠淋巴瘤細胞進行的體外哺乳動物細胞基因突變試驗（MLA試驗）、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗進行遺傳毒性檢測。細胞毒試驗，將樣品放置在固化的瓊脂層上與L929細胞間接接觸24 h，用中性紅對細胞進行染色后顯微鏡下觀察細胞毒性。Ames試驗選用TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五種組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株，觀察腸鏡潤滑消泡劑對細菌回復突變率的影響;MLA試驗采用小鼠淋巴瘤細胞與樣品溶液接觸3 h和24 h，通過計算其平板效率和大小集落形成數目計算突變頻率，判斷受試樣品對小鼠淋巴瘤細胞突變率的影響;體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗，使樣品溶液與中華地鼠肺細胞（CHL細胞）接觸6 h和24 h，通過對處于有絲分裂中期的CHL細胞的染色體畸變情況進行分析，評價腸鏡潤滑消泡劑對CHL細胞潛在的致突變性。結果? 在細胞毒試驗中，受試樣品與陰性對照相比，細胞數量相對較少且受試樣品顯微鏡下觀察有少量畸形和退化的細胞，為輕微的細胞毒性;Ames試驗樣品組回變菌落數均未比陰性對照回變菌落數增加1倍或者1倍以上且無重復性;MLA試驗樣品組MF值與陰性對照相比無超過126×10-6的增長;染色體畸變試驗受試樣品組染色體結構畸變率與陰性對照相比，差異無統計學意義（P>0.05）。結論? 以二甲基硅油、甘油、羧甲基纖維素鈉為成分的腸鏡潤滑消泡劑無潛在的細胞毒性和遺傳毒性，可進一步用于臨床研究。

關鍵詞：腸鏡潤滑消泡劑;Ames試驗;MLA試驗;細胞毒性;遺傳毒性

中圖分類號：R394? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.019

文章編號：1006-1959（2019）16-0062-05

Abstract：Objective? To evaluate the cytotoxicity and genotoxicity of a colonoscopy lubricant defoamer based on dimethyl silicone oil， glycerin and sodium carboxymethyl cellulose， and provide clinical use for this colonoscopy lubrication defoamer and biosafety basis.Methods? The agar diffusion test was used to detect the in vitro cytotoxicity of the colon gel lubrication defoamer. The bacterial back mutation test （Ames test）， the in vitro mammalian cell gene mutation test （MLA test） using mouse lymphoma cells， and the in vitro breastfeeding were selected. Genotoxicity testing for animal cell chromosome aberration test. In the cytotoxicity test， the sample was placed on the solidified agar layer for indirect contact with L929 cells for 24 h， and the cells were stained with neutral red， and the cytotoxicity was observed under a microscope. Ames test used TA97a， TA98， TA100， TA102， TA1535 five histidine-deficient Salmonella typhimurium strains to observe the effect of colonoscopy lubrication defoamer on bacterial reversion rate; MLA test using mouse lymphoma cells and sample solution After 3 h and 24 h of exposure， the mutation frequency was calculated by calculating the plate efficiency and the number of colony formation， and the effect of the test sample on the mutation rate of mouse lymphoma cells was determined. In vitro mammalian cell chromosome aberration test， the sample solution and the Chinese hamster lung cells （CHL cells） were exposed for 6 h and 24 h. The chromosomal aberrations of CHL cells in the middle stage of mitosis were analyzed to evaluate the potential mutagenicity of colon gel lubrication defoamers on CHL cells.Results? In the cytotoxicity test， the number of cells in the test sample was relatively small compared with the negative control， and a small amount of abnormal and degraded cells were observed under the microscope of the test sample， which was mild cytotoxicity; The number of colonies did not increase by 1 time or more than the number of colonies of the negative control and there was no repeatability; the MF value of the MLA test sample group did not exceed 126×10-6 growth compared with the negative control; the chromosome aberration test was subjected to the sample. There was no significant difference in the chromosome structural aberration rate between the group and the negative control （P>0.05）.Conclusion? The colonoscopy lubricant defoamer with dimethyl silicone oil， glycerin and sodium carboxymethyl cellulose has no potential cytotoxicity and genotoxicity and can be further used in clinical research.

Key words：Colonoscopy lubrication defoamer;Ames test;MLA test;Cytotoxicity;Genotoxicity

腸鏡檢查是一種內窺式最直觀的腸道檢查方法，可以幫助醫生了解患者腸道內部的情況，是檢查腸道內部病變的一種常用診斷方式。同時，潤滑消泡劑的使用是提高腸鏡檢查效率最簡單、最方便、最經濟的方法[1]。腸鏡潤滑消泡劑既可以減少腸鏡與腸道黏膜的摩擦進而減輕患者的嘔心感和疼痛感，也降低了醫生操作腸鏡的難度。作為一種表面接觸醫療器械，由于它直接與人體腸道粘膜接觸且使用后是由人體自身將其代謝排出，因此，對腸鏡潤滑消泡劑進行細胞毒性和遺傳毒性評價尤為重要。本文通過體外細胞毒性和遺傳毒性試驗，對主要成分為二甲基硅油、甘油及羧甲基纖維素鈉的受試樣品的生物安全性作較詳細的評價，為腸鏡潤滑消泡劑的發展及其在生物臨床應用中提供安全可靠的依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1受試樣品? 受試樣品為腸鏡潤滑消泡劑;在無菌條件下，依據GB16886.12-2017的標準要求，取樣品適量溶解在生理鹽水中，作為Ames試驗的樣品溶液;取樣品適量溶解在含10%馬血清的RPMI1640培養基中，作為MLA試驗的樣品溶液;取樣品適量溶解在含10%胎牛血清的MEM培養基中，作為體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗的樣品溶液。

1.1.2試驗菌株? TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五種組氨酸缺陷型菌株，購自美國mltox公司;按照標準GB16886.3-2008的要求對五種菌株進行了組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷鑒定、R因子檢查、uvrB修復缺陷型鑒定、四環素抗性鑒定及菌株的自發回變菌落數鑒定，鑒定結果均在規定的正常范圍內。

1.1.3試驗細胞株? 小鼠淋巴瘤細胞L5178Y TK+/-3.7.2C，購自China Center For Type Culture Collection;用含10%馬血清的RPMI1640培養基在37℃，5%CO2的培養箱中培養，細胞生長良好，懸浮生長正常，試驗前先對L5178Y TK+/-3.7.2C細胞進行自發突變消除。中華地鼠肺細胞（CHL細胞），購自American Type Culture Collection;小鼠成纖維細胞（L929細胞），購自China Center For Type Culture Collection，用含10%胎牛血清的MEM培養基在37℃，5%CO2的培養箱中培養，細胞生長良好，貼壁生長正常。

1.1.4主要試劑? 肝微粒體酶（S9），moltox公司產品;還原性輔酶Ⅱ（NADP），AMRESCO公司產品;2，4，7-三硝基-9-芴酮，AccuStandard公司產品;疊氮化鈉（DDN），山東西亞化學工業有限公司產品;秋水仙素，aladdin公司產品;姬姆薩儲備液，BASO公司產品;葡萄糖-6-磷酸鈉鹽（G-6-P）、絲裂霉素C（MMC）、三氟胸苷（TFT）、環磷酰胺（CP）、4-硝基喹啉氧化物（NQO）、1，8-二羥基蒽醌、二甲基亞砜（DMSO），中性紅（NR），SIGMA公司產品;2-氨基芴（2-AF）、RPMI1640培養基、馬血清（HS）、MEM培養基、胎牛血清（FBS），Thermo fisher公司產品;其他試劑均為進口或國產的分析純。

1.1.5主要儀器? 生化培養箱，日本三洋貿易株式會社產品;恒溫振蕩器，上海一恒儀器有限公司產品;CO2培養箱，美墨爾特有限公司產品;倒置顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社產品;二氧化碳恒溫振蕩器，蘇州捷美電子有限公司產品;纖維圖像采集工作站，熒光倒置顯微鏡，德國徠卡微系統有限公司產品。

1.2方法

1.2.1細胞毒試驗? 選擇瓊脂擴散法對受試樣品進行細胞毒性檢測，將適宜濃度的L929細胞接種到90 mm的平皿中培養至近匯合狀態，棄去培養基加入10 ml熔化瓊脂培養基與含20% FBS培養基的混合液，使瓊脂的最終質量濃度為1%。將受試樣品小心的放置在平皿的固化瓊脂上，同時用不含酚紅MEM培養基作為陰性對照，用DMSO作為陽性對照，在培養箱中37℃培養24 h后選擇NR進行染色，在避光條件下繼續孵育3 h，顯微鏡觀察受試樣品的細胞毒性[2]。

1.2.2 Ames試驗? 采用平板滲入法進行試驗。將TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535菌株接種到肉湯培養基中并在37℃振蕩培養以獲得適宜濃度的菌懸液。依次在熔化的頂層培養基中加入菌液，受試樣品溶液（終濃度5 mg/皿），分設+S9組和-S9組，同時用樣品溶劑生理鹽水作為陰性對照，表1所列陽性劑作為陽性對照，振蕩混勻后傾入到底層培養基上，各劑量組均平行做3個平皿，在培養箱中37℃倒置培養48 h后進行回變菌落數計數，以（x±s）來表示。當樣品誘發的回復突變菌落數比陰性對照增加1倍以上且具有可重復性，則可判為樣品存在潛在致突變性[3]。

1.2.3 MLA試驗? 采用96微孔板法進行試驗。將L5178Y TK+/-3.7.2C細胞調到適宜的濃度與樣品溶液接觸3 h和24 h，3 h接觸分設+S9組和-S9組，同時用樣品溶劑含10%HS的RPMI1640培養基作為陰性對照，用NQO和CP作為無活化系統和有活化系統的陽性對照。接觸結束后調整細胞濃度為8個/ml，每個劑量組接種至2塊96孔板中為第0天平板接種效率（PE0）。剩余細胞繼續培養2 d，每天計數細胞數量并調整細胞濃度;第2天表達培養結束后調整細胞濃度為8個/ml，每個劑量組接種至2塊96孔板中為第2天平板接種效率（PE2），同時取適量的細胞液，調整細胞濃度為1×104個/ml，加入終濃度為3 μg/ml的TFT，接種至2塊96孔板中以計算TFT抗性突變頻率（MF），置于培養箱中37℃，5% CO2的培養14 d后，用肉眼或顯微鏡觀察PE0和PE2每塊板有集落形成的孔數及MF平板中96孔板內的大集落數（LC）和小集落數（SC），并根據觀察結果計算細胞懸浮增長率（SG）、相對總增長率（RTG）、平板接種效率（PE0和PE2）和突變頻率（MF）。

1.2.4體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗? 將生長良好的CHL細胞調整至適宜濃度接種到培養皿中與樣品溶液接觸6 h和24 h，6 h接觸分設+S9組和-S9組，同時用樣品溶劑含10% FBS的MEM培養基作為陰性對照，用MMC和CP作為無活化系統和有活化系統的陽性對照。接觸結束后用Hanks液洗滌細胞3次，加入培養基繼續培養。在收獲細胞前3 h加入終濃度為1 μg/ml細胞分裂中期阻斷劑秋水仙素。培養結束后用胰蛋白酶液消化細胞，記錄細胞數量，對細胞進行離心、低滲、清洗、固定后得到新鮮混懸液。用混懸液制片，室溫下自然干燥，并用姬姆薩染液染色。在光學顯微鏡下，每組挑選200個中期分裂相（染色體數為2n±2）進行染色體畸變分析。記錄下觀察到的染色體數目和畸變類型。

1.3觀察指標? 細胞毒性試驗結果、Ames試驗結果、計算SG、RTG、PE0、PE2和MF;計算相對細胞增長數、細胞畸變數和染色體結構異常百分率。根據OECD標準中的GEF因子規定，若樣品組MF值即突變頻率與陰性對照組相比超過126×10-6的增長，則判斷樣品結果為陽性[4]。

1.4統計學方法? 采用SPSS 24.0統計軟件對染色體畸變數進行統計分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為統計學意義顯著。

2結果

2.1細胞毒試驗結果? 在顯微鏡下觀察細胞形態見圖1，陰性對照和受試樣品在樣品周圍和下方未觀察到明顯細胞毒性反應區域，受試樣品與陰性對照相比，細胞數量相對較少且受試樣品顯微鏡下觀察有少量畸形和退化的細胞，為輕微的細胞毒性，反應級別為1級，符合醫療器械細胞毒性等級要求。

2.2 Ames試驗結果? 在5 mg/皿的受試濃度下，陰性對照回變菌落數在自發回變菌落數正常范圍，陽性對照組回變菌落數至少為陰性對照的3倍，試驗條件成立。樣品組腸鏡潤滑消泡劑回變菌落數均未比陰性對照回變菌落數增加1倍或者1倍以上且無重復性，故-S9和+S9的試驗條件下，腸鏡潤滑消泡劑50 mg/ml濃度的樣品溶液細菌回復突變試驗結果均為陰性，見表2。

2.3 MLA試驗結果? 陰性對照的PE0和PE2結果均在65%～120%，T-MF在50×10-6～170×10-6，對于4 h接觸實驗細胞總SG在8～32倍，對于24 h接觸實驗細胞總SG在32～180倍;陽性對照的T-MF比陰性對照高300×10-6以上，其中陽性對照的S-MF比陰性對照高150×10-6以上;各劑量組的RTG都不小于10%。試驗結果表明，樣品組MF值與陰性對照相比無超過126×10-6的增長。故-S9和+S9的試驗條件下，腸鏡潤滑消泡劑溶液體外哺乳動物細胞基因突變試驗結果為陰性，見表3、表4。

2.4體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗結果? 陽性對照與陰性對照相比，統計學意義顯著（P<0.01）。在陰性對照中的細胞毒性標準符合要求，樣品5 mg/ml濃度的溶液細胞生長率>60%，因此樣品5 mg/ml濃度的溶液可提供足夠數量的細胞供結果分析，試驗條件成立。受試樣品組染色體結構畸變率與陰性對照相比，差異無統計學意義（P>0.05），且樣品延長24 h接觸處理的結果與陰性對照相比，差異無統計學意義（P>0.05），故-S9和+S9的試驗條件下，腸鏡潤滑消泡劑溶液體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗結果均為陰性，見表5。

3討論

腸鏡潤滑消泡劑是一種器械治療輔助性醫療器械，按照醫療器械在預期臨床使用中與人體皮膚、組織或粘膜接觸的性質和時間等對醫療器械分類，進而依據GB/T 16886/ISO 10993系列標準對其進行生物學評價試驗[5]。在臨床使用過程中，腸鏡潤滑消泡劑在使用后是由人體通過自身的代謝循環將其排出體外或被胃腸道粘膜所吸收，作為一種與粘膜長期接觸的表面醫療器械，對其通過細胞毒性和遺傳毒性試驗以分析評價該產品對人體是否有潛在的風險十分重要，本文所研究的腸鏡潤滑消泡劑，其主要成分包括二甲基硅油、甘油及羧甲基纖維素鈉。據有關研究表明，二甲基硅油成本低，在胃腸鏡檢查中能改變氣泡表面張力，減少腸道內氣泡，且不被血液吸收，安全有效，具有較好的消泡效果[6]。甘油具有保濕和潤滑的作用，可延長藥物在檢查中腸道內的停留時間，有利于檢查[7]。羧甲基纖維素鈉是一種高分子防粘連材料，由于其具有流動性、可壓性和潤滑黏膜的黏滯性，能夠隨著器官的蠕動漫布整個腹腔，因此可以有效的防止腸道內部粘連的形成[8]。目前國內外關于腸鏡檢查用的潤滑消泡劑成分種類多，但尚無統一的認識和行業規范[9]，二甲基硅油、甘油、羧甲基纖維素鈉雖均為胃腸道潤滑消泡劑的常用成分且在臨床的使用效果良好，但目前在國內外尚無此類腸鏡潤滑消泡劑或者是關于其主要成分二甲基硅油、甘油和羧甲基纖維素鈉的相關生物學評價研究，尤其是細胞毒性和遺傳毒方面的研究極少，因此本文通過對一種以二甲基硅油、甘油、羧甲基纖維素鈉為成分的腸鏡潤滑消泡劑進行細胞毒性和遺傳毒性評價，為該種腸鏡潤滑消泡劑在醫學臨床使用提供生物安全依據，同時也為其他同類型潤滑消泡劑提供借鑒。

對腸鏡潤滑消泡劑進行體外細胞毒性評價，因為采用浸提液法會改變受試樣品的pH值，進而影響試驗結果且樣品在臨床使用時是直接與人體黏膜接觸，所以本研究選用瓊脂擴散法進行體外細胞毒性評價。對腸鏡潤滑消泡劑的遺傳毒性評價，由于沒有一種單一的遺傳毒性試驗方法可檢測所有遺傳毒性終點，故遺傳毒性評價大多采用組合試驗的方法。本研究根據人用藥物注冊技術要求國際協調會議（ICH）提出的標準組合試驗[10]，選擇的試驗包括Ames試驗、MLA試驗和體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗，該組合具備了以下兩個特點：一是涵蓋了不同進化程度的物種（包括原核細胞和真核細胞），二是包含了不同遺傳學檢測終點（基因突變和染色體畸變），從而合理的反映腸鏡潤滑消泡劑的潛在的遺傳毒性。同時，由于大部分的化學物質需要經過代謝活化才能引起致突變作用，因此本研究中遺傳毒試驗均從有活化系統（大鼠肝微粒體酶S9）和無活化系統同時對腸鏡潤滑消泡劑進行更全面的評價[11]。

總之，以二甲基硅油、甘油、羧甲基纖維素鈉為成分的腸鏡潤滑消泡劑作為一種與人體粘膜長期接觸的表面醫療器械在細胞毒性和遺傳毒性方面均是安全可靠的，為將來腸鏡潤滑消泡劑的發展及在動物實驗和臨床上的使用提供了穩定可靠生物安全依據。

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收稿日期：2019-5-28;修回日期：2019-6-24

編輯/楊倩