芘對毛霉胞外聚合物質特性的影響

劉長風 李欣燕 賈春云

摘要：多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）是由2個以上苯環連在一起的化合物，具有強烈的致癌、致畸、致突變作用，屬于持久性有毒有害有機污染物。由于胞外聚合物（extracellular polymeric substances，簡稱EPS）的成分性質，EPS對PAHs有較高的降解效果。因而EPS在去除PAHs過程中的應用越來越受到重視。為研究芘對毛霉EPS產生的影響，分析比較不同濃度芘誘導后毛霉EPS的特征、生化成分和生物降解效果。用濃度梯度為0、10、20、40、80、120 mg/L的芘誘導毛霉，提取EPS進行表征及降解試驗。結果表明，隨著芘濃度的增加，毛霉EPS粉末表面松散程度增強，孔隙數量變多而且直徑變大;EPS的蛋白質含量、多糖含量、類腐殖質含量均逐漸增長，并且當芘濃度達到80 mg/L時，這些值均達到峰值（EPS提取量為1 561 mg/L，糖類含量為1 042 mg/L，蛋白質含量為 562 mg/L，類腐殖質含量為312 mg/L）。當芘濃度為120 mg/L時，毛霉EPS粉末又重新變成板結狀;EPS提取量和各種生化成分均減少，對芘的降解率也降低。與其他毛霉相比，以80 mg/L芘誘導后的毛霉EPS對芘有更強的生物降解能力。

關鍵詞：毛霉胞外聚合物;目標污染物芘;生物降解;特性分析;污染土壤修復

多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）污染是世界各國所面臨的重大環境與公共健康問題之一，其對土壤的污染問題尤為突出[1]。PAHs污染土壤的修復是當前國內外環境科學界的共同話題和主攻熱點。與物理、化學修復法相比，生物修復技術具有非破壞性、經濟性和安全性等優點，可廣泛應用于中低濃度大面積PAHs污染土壤的修復，近年來在國內外引起廣泛關注[2-3]。其中，微生物修復技術應用最廣泛，主要是通過馴化土著微生物或人為投加外源微生物對土壤中PAHs進行轉化、降解與去除[4]。微生物降解多環芳烴已成為最主要的多環芳烴污染土壤的修復技術。具有PAHs降解能力的細菌較多，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、假單胞菌屬（Pseudomohas）等[5]。真菌降解PAHs的效率通常高于細菌，在降解高環多環芳烴方面表現突出。研究表明，一些絲狀真菌、擔子菌、白腐菌和半知菌對四環或更高環數PAHs的降解具有一定的優勢[6-7]。

PAHs污染土壤微生物修復過程中，胞外聚合物（extracellular polymeric substances，簡稱EPS）承接細胞壁及土壤表面PAHs，具有重要的橋聯作用。EPS通過范德華力或乳化作用解吸土壤中的PAHs，增強PAHs的生物可利用性[8-10]。楊智臨等研究發現，EPS與菌株聯用處理石油污染土壤時，萘去除率達96%，菲去除率達100%[11]。EPS中的蛋白質和糖類，特別是蛋白質中色氨酸殘基，對有機污染物的去除起重要作用。Pan等通過熱力學計算得出活性污泥EPS與菲的作用是自發的、放熱的，疏水相互作用是主要作用方式，且蛋白峰中的色氨酸參與其中[12]。Zhang等報道，一羥基芘（PAHs的代謝生物標記物）能與牛血清蛋白中的色氨酸殘基發生鍵合作用[13]。此外，EPS中多糖結合態PAHs的生物利用率較高[14]。

可見，EPS中蛋白和糖類參與PAHs的降解過程，有關EPS的提取和表征方法已比較成熟。EPS的提取方法包括物理、化學提取法。物理提取法主要是利用物理手段增加胞外聚合物在溶液中的溶解度，從而達到提取EPS的目的。如熱提取法、離心法、超聲波提取法等。化學提取法是利用生物膜的內傳質作用使試劑中的離子或分子進入生物膜并與胞外聚合物發生接觸，胞外聚合物的大分子會轉化成為水溶性成分進而被提取出來。NaOH提取法是比較常用的方法，此外還有乙二胺四乙酸提取法、硫酸提取法、陽離子交換樹脂法、甲醛超聲波法等[15-18]。化學提取法雖然產率高，但樣品易被流出的胞內物質污染[19]。EPS的表征方法較多，EPS成分用色譜、質譜及其組合進行定性和定量分析[20];胞外聚合物的功能基團和元素組成用X-射線光電子能譜、紅外光譜、三維熒光光譜、核磁共振等儀器解釋[21-25];EPS形貌一般用掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡來表征。

為了深入研究EPS在PAHs污染土壤修復中的作用，本試驗以毛霉EPS為研究對象，以芘為目標污染物，通過室內模擬試驗，聯合多種檢測技術，探索芘對毛霉EPS的特征影響。

1 材料與方法

1.1 試驗用菌種及培養

試驗用毛霉（Mucor mucedo）菌種由中國科學院沈陽應用生態研究所土壤污染生態組提供。斜面培養基（PDA）：馬鈴薯去皮后洗凈，稱取200 g切成小塊，加1 L水煮沸20 min，濾去馬鈴薯塊，冷卻后加入20 g葡萄糖，定容至1 L，pH值自然，在1×105 Pa滅菌30 min。種子培養基：4.000%蔗糖，0.400%（NH4）2HPO4，0.100% KH2PO4，0.050% MgSO4·7H2O，0.005%維生素B1，pH值為6.5。在250 mL三角瓶中裝入150 mL液體種子培養基，在1×105 Pa滅菌20 min，冷卻后接入菌種，在搖床（溫度為25 ℃，轉速為120 r/min）中振蕩培養。

1.2 毛霉EPS的提取方法

取40 mL生長到穩定期的菌體培養液，于2 000 r/min離心10 min，棄去上清液補充無菌水至原體積，于2 000 r/min離心3 min，棄去上清液補充無菌水至原體積，重復2次，去除液體培養基中的雜質，然后用加熱法提取EPS。將上述菌懸液放入60 ℃的水浴鍋中加熱30 min，然后把樣品在 8 000 r/min 離心10 min，上清液經過0.22 μm濾膜過濾后，得到的無色透明溶液即為EPS溶液，濃度用總有機碳（total organic carbon，簡稱TOC）來表示，TOC由mulit N/C3000 TOC測定儀測定。

1.3 毛霉對芘的降解試驗

將真菌轉接到液體培養基中，在30 ℃培養3 d。將單株菌株按10%的接種量接種到芘濃度分別為10、20、40、80、120 mg/L 的20 mL液體無機鹽培養基（0.05% 酵母膏，0.50% NaCl，1.00% NH4NO3，0.50% K2HPO4，0.50% KH2PO4，0.02% MgSO4·7H2O，0.05%蔗糖）中，在30 ℃、130 r/min條件下振蕩培養，取樣分析培養基中芘的殘留濃度。

1.4 芘濃度測定

芘的提取方法采用二氯甲烷萃取，首先將三角瓶中溶液過0.45 μm水相濾器，然后向濾后溶液中加入等體積的二氯甲烷，放入振蕩器（溫度為25 ℃，轉速為180 r/min）中振蕩 5 min，全部移入50 mL分液漏斗中，靜置5 min，分層后將下層有機相存入燒杯，每個樣品按此步驟重復萃取3次。將上述3次萃取液混勻，轉移至燒杯中使用普通氮氣吹至近干，最后用甲醇定容，過0.22 μm有機濾膜后移入液相色譜專用進樣瓶中[26-27]。芘的濃度采用高效液相色譜法測定，儀器為Agilent-1200高效液相色譜儀。色譜儀主要設定參數：流動相為100%甲醇，流速為0.8 mL/min，可變波長檢測器（variable wavelength detector，簡稱VWD）檢測波長為254 nm，柱箱溫度為35 ℃，進樣量為10 μL。

1.5 EPS化學成分分析

糖類含量的測定采用硫酸-苯酚法[28]，蛋白質和腐殖酸的測定采用修正的Folin-Lowry法[29]，DNA的測定采用二苯胺法[30]。

1.6 EPS形態特征分析

EPS的形態特征采用環境掃描電子顯微鏡進行檢測，將準備好的EPS樣品冷凍干燥成粉末狀，將制備好的EPS粉末粘在樣品臺上，鍍金后照相檢測。

1.7 EPS三維熒光光譜分析

提取的EPS樣品可直接進行三維熒光測定。熒光光度計參數設定：發射掃描波長為0.25～0.65 μm，激發掃描波長為0.20～0.55 μm，激發和發射狹縫寬度為5×10-3 μm，掃描速度為12 μm/min，響應時間為自動方式，掃描光譜進行儀器自動校正。

1.8 EPS紅外光譜分析

將提取到的EPS樣品經真空干燥（-60 ℃，24 h），取適量的粉末用傅里葉紅外光譜儀（型號：NICOLET380）進行測定，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32次/min，測定范圍為 4 000～500 cm-1。

2 結果與分析

2.1 毛霉EPS釋放和芘降解的關系

由圖1可知，隨著污染物芘的濃度由0增加到 120 mg/L，毛霉EPS的含量呈先增大后減少的趨勢。不加污染物芘時，提取的毛霉EPS含量為741 mg/L，10 mg/L芘誘導毛霉EPS的提取量增加到813 mg/L，隨著芘濃度的增加，提取到的EPS含量也在持續增加，直到芘的濃度增加到 80 mg/L 時，EPS的提取量達到峰值，為1 561 mg/L，比原毛霉EPS的提取量增加了820 mg/L，而120 mg/L芘則明顯抑制了EPS的提取量，使其降低到403 mg/L，這說明芘的濃度小于80 mg/L可以促進毛霉EPS的分泌，而過高濃度的芘則起到抑制作用。隨著芘濃度由10 mg/L增加到80 mg/L時，TOC值逐漸上升;芘濃度為120 mg/L時，毛霉對多環芳烴的降解率明顯下降，其對芘的降解率由80%下降到43.8%。這與Machín-Ramírez等的研究結論[31-33]一致。Machín-Ramírez等以黑曲霉、木霉霉菌、釀酒酵母菌、粘質沙雷氏菌、芽孢桿菌、假單胞菌屬等降解苯并芘，最大降解率為65%（初始濃度為50 mg/L）[31];Zafra等使用綠色木霉H15、曲霉H7、黃曲霉等多種真菌和細菌聯用降解芘，14 d后，芘的降解率為 48.18%[32];Jia等的研究表明，毛霉對芘（初始濃度為 37.9 mg/L）的最大降解率為86.5%[33]。這些數據證實了真菌和細菌對芘的生物降解能力。

2.2 芘對毛霉EPS生化成分的影響

2.2.1 不同芘濃度下毛霉EPS主要成分含量的變化 由圖2可知，毛霉EPS的4種主要成分中糖類的含量最高，其次為蛋白質，再次為類腐殖質，最后為DNA（由于提取EPS過程中沒有破壞細胞核，EPS中DNA含量極低），隨著污染物芘的濃度由0增加到120 mg/L，提取毛霉EPS中的糖類、蛋白質、類腐殖質含量呈先增大后減小的規律，而DNA的含量基本不變，這可能是因為毛霉為真核微生物，真核微生物的DNA一般多數在細胞核內，加熱法提取EPS為物理方法，對細胞破損較小，不會破壞細胞核結構，因此DNA含量基本保持不變。綜合不同濃度芘誘導毛霉EPS提取量的試驗結果進行分析，4種主要成分中除DNA外，隨著芘濃度增加的變化規律與毛霉EPS提取量的變化規律相同。80 mg/L芘誘導下，EPS的提取量與糖類、蛋白質、類腐殖質的含量均出現峰值。說明微生物在芘的誘導下，細胞會分泌降解所需的酶和糖類，而高濃度的芘則會對細胞產生毒性，從而抑制了微生物的生長，進而抑制其EPS的分泌。

毛霉EPS主要成分為糖類和蛋白質，其次為類腐殖質等，這與李紹峰等的研究結論[34-35]一致。與污泥EPS的主要成分為多糖和蛋白質的研究結果[36]也相似。加入芘誘導后蛋白質和多糖含量發生變化，因此，污染物芘對EPS的成分產生影響。Yue等從污水處理廠中分離出脫硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）菌株，培養過程中加入Cu2+、Zn2+、Cd2+，分析結果表明重金屬的存在增加了EPS表面官能團的濃度[37]。

2.2.2 芘對毛霉EPS紅外光譜的影響 由圖3可知，光譜圖上均出現多個吸收峰，說明EPS中存在較多官能團。3 400～3 200 cm-1 處的譜峰可歸屬為細胞表面蛋白質N—H鍵的伸縮振動和碳水化合物中結合水的O—H鍵的伸縮振動。1 650～1 620 cm-1處的譜峰來自典型的細胞蛋白質酰胺Ⅰ帶（C—O的伸展振動）和酰胺Ⅱ帶（N—H的彎曲振動與C—N伸展振動的疊加）。1 380～1 330 cm-1處的譜峰是烷基C—H伸縮振動的吸收帶。1 200～1 000 cm-1處的譜峰是C—O鍵伸展振動的吸收帶，譜帶強，主要是多糖C—O鍵的伸展振動吸收，稱為多糖區。另外，指紋區（1 330～400 cm-1）出現多個吸收峰，是由于整個分子振動轉動引起的，表明毛霉EPS中存在著含硫、磷基團。由光譜a與光譜b、c、d、e、f比較可知，由光譜a中 3 346 cm-1 處寬而大的蛋白峰在光譜b、c、d、e、f中分別為 3 345、3 278、3 255、3 282、3 355 cm-1，C—O鍵向低波數移動，C—O鍵鍵長縮短，發生了紅移，且隨著芘濃度由10 mg/L增加到80 mg/L，移動長度由1 cm-1增加到 364 cm-1，當芘濃度增加到120 mg/L時，C—O鍵向高波數移動，C—O鍵鍵長增長，發生了藍移，說明在芘誘導毛霉時EPS中的蛋白質參加了反應，且隨著芘濃度的增大毛霉EPS中蛋白質對毛霉降解芘的促進作用呈先增大后減小的趨勢。光譜a中1 555 cm-1處譜峰為酰胺（OCN—H）Ⅰ帶，是C=O鍵的伸縮振動，誘導前后從11 648 cm-1分別移動到1 626、1 635、1 632、1 632、1 621 cm-1，這說明毛霉降解芘時，毛霉EPS中主要是羥基和酰胺基起主要作用。光譜a中 1 038 cm-1 處峰在不同濃度芘誘導后的光譜b、c、d、e、f中分別移至1 042、1 069、1 042、1 031、1 072 cm-1，發生紅移，說明在毛霉降解芘時，EPS中多糖上的—COO被消耗，減少了 —COO 的含量。說明，在毛霉降解芘的過程中，EPS的主要成分糖類促進了降解反應的進行，隨著芘濃度的增大蛋白質的促進作用呈現先增大后減小的規律。

紅外光譜分析結果中羥基、酯基是疏水基團，羥基、羧基、

醛基、氨基和磺酸基是親水基團。眾所周知，蛋白質和多糖影響微生物菌株EPS的物理化學性質、疏水性和絮凝性[38]。EPS和污染物之間的驅動力主要來自疏水相互作用、氫鍵或靜電相互作用[39]。由于EPS中存在一些疏水區域，許多有機污染物如菲、苯、染料（如甲苯胺藍）等都可以被EPS吸收[40-41]。因此，在芘生物降解過程中，芘誘導后微生物EPS對芘降解效果的影響比原微生物的EPS更有效。

2.2.3 芘對毛霉EPS三維熒光光譜的影響 在0.230/0.350 μm 的激發/發射波長（Ex/Em）處識別出第一主要熒光峰（峰1），而另一個主峰（峰2）位于Ex/Em=0.275/0.350 μm 處。根據Hudson的分類[42]，這2個峰位于Ⅰ（芳香族蛋白質）和Ⅱ（芳香族蛋白質）的區域。它們與衍生自其中的芳香族氨基酸如酪氨酸和色氨酸蛋白質的化合物相關。

由表1可知，污染物芘的濃度由10 mg/L增加到 80 mg/L，熒光強度逐漸增強，色氨酸和酪氨酸含量隨之上升，說明芘對毛霉向胞外分泌蛋白都有一定的促進作用，其中芘的濃度為80 mg/L時，蛋白峰的熒光強度達到最大值，色氨酸和酪氨酸含量最高。當芘的濃度為120 mg/L時，蛋白峰的熒光強度達到最小值，色氨酸和酪氨酸含量最低。也就是說，120 mg/L芘抑制了毛霉向胞外分泌蛋白。因此，適量芘誘導后，毛霉EPS中色氨酸含量增加。芘的加入使得EPS的峰1和峰2的熒光強度發生變化，這直接影響了EPS在芘去除過程中的作用。值得注意的是，經0～80 mg/L芘誘導，毛霉EPS在 0.230/0.350 μm的激發/發射波長處的類蛋白1，熒光強度由86.45 a.u.上升至221.30 a.u.;在 0.275/0.350 μm 的激發/發射波長處的類蛋白2，熒光強度由202.10 a.u.上升至243.10 a.u.;芘的濃度超過80 mg/L后峰1熒光強度減至 31.65 a.u.，峰2熒光強度減至180.10 a.u.。

芳香族蛋白質物質和類腐殖質是提取的EPS樣品中的2種主要物質，特別是蛋白質中色氨酸殘基，對有機污染物的去除起重要作用。通過熱力學計算得出，EPS對菲的降解是自發的、放熱的，疏水相互作用是主要作用方式，且蛋白峰中的色氨酸參與其中[12]。Zhang等報道，一羥基芘（PAHs的代謝生物標記物）能與牛血清蛋白中的色氨酸殘基發生鍵合作用[13]。

2.3 芘對EPS表征的影響

圖4為不同濃度芘誘導下液體培養毛霉EPS粉末放大 5 000倍的掃描電鏡照片，由圖4-a可知，未經馴化的毛霉EPS呈板結塊狀，四周凸起部分呈鋒利薄片狀。隨著芘的濃度由10 mg/L增加到80 mg/L，EPS粉末逐漸變得松散多孔，尤其是80 mg/L芘誘導下的毛霉EPS的照片呈毛絨狀，空隙量多

而且大，而120 mg/L芘誘導下的毛霉EPS沒粉末又重新變成板結狀。說明芘誘導明顯影響毛霉EPS的結構，芘誘導后EPS具有更大的接觸面和吸附力，能更好地促進芘的生物降解。

3 討論與結論

EPS是同時含有親水和疏水部分的兩親性化合物。因此，EPS可顯示可溶疏水底物的表面活性[43]。在相互作用的初始階段會產生使EPS和芘共聚的吸引力，如疏水相互作用[44-46]。在我國的報告中，EPS和PAHs之間的相互作用是自發的和放熱的，PAHs與EPS的結合主要由疏水相互作用[47]。一些研究報道引入化學物質，如合成表面活性劑、生物吸收劑、細菌聚合物等，可以增強PAHs從土壤表面的解吸[48-50]。Liu等認為，細菌產生的細胞外聚合物可以增強吸收菲的釋放程度[8]。因此，可以推斷EPS可以增強芘在土壤表面的釋放，進而增強PAHs的生物降解效果。

此外，馴化后EPS形態和成分的變化對PAHs的生物降解也有影響。電鏡下未經馴化的黑曲霉EPS呈不規則塊狀，顆粒大且結塊，使用未經馴化的黑曲霉降解芘，降解率達 56.61%[51]，與馴化過的毛霉相比降解率略低（80 mg/L芘馴化降解率為80%），除去菌種自身降解能力外，未經馴化的菌種EPS較為平滑，與馴化過的毛霉EPS相比，EPS與PAHs的接觸面積較小，因而降解能力略低。就成分而言，微生物分泌的胞外蛋白作為介質為微生物攝入外來物質，胞外多糖起到對物質的吸附和絮凝作用，腐殖酸與有機物產生吸附和配合作用，形成大分子絡合物[52-53]。幾種化合物相互配合使得EPS與生物體間發生離子架橋、靜電中和等反應所表現出的黏結性，有利于對多環芳烴的溶解吸附，提高微生物對多環芳烴的去除能力[54]，本試驗結果與其基本一致。鑒于EPS的生物降解作用以及馴化后EPS形態和成分的變化，可以推測馴化后毛霉EPS對芘有更強的生物降解效果。

毛霉是高效的芘降解菌株，芘濃度為80 mg/L時，芘誘導后毛霉產生的EPS量最大，為1 561 mg/L，其中糖類含量為 1 042 mg/L，蛋白質含量為562 mg/L，類腐殖質的含量為 312 mg/L。0～80 mg/L芘誘導后毛霉EPS熒光強度漸強，這說明色氨酸和類腐殖質的蛋白質樣物質的量有所增加。因此，80 mg/L芘誘導后毛霉產生的EPS更能促進芘的生物降解效果。80 mg/L芘誘導后的毛霉EPS呈毛絨狀，質地疏松，接觸面更大，吸附力更強，可以更好地促進芘的生物降解。

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