鈷銫鍶3種核素對大腸桿菌的毒性研究

黃志 顏未 蒯琳萍

摘要：為了研究核電站建設運營、礦源開采等行為對周邊環境的影響，以大腸桿菌為對象，通過繪制生長曲線以及MTT（噻唑藍）法定量測量鈷（Co）、銫（Cs）、鍶（Sr）3種核素對大腸桿菌的毒性作用，得到了鈷、銫、鍶3種核素與大腸桿菌的劑量-抑菌率關系，同時通過測定細胞壁通透性以及胞內活性氧含量，發現這3種離子對大腸桿菌的抑菌作用與細胞壁通透性以及胞內活性氧的積累可能存在正相關關系。結果表明，Co2+、Sr2+、Cs+對大腸桿菌的半致死濃度分別為3.38、251、1 600 mg/L，其金屬毒性由強到弱順序為Co2+>Sr2+>Cs+，并且Sr2+對大腸桿菌生長具有雙向性影響，低濃度（<10 mg/L）時表現為促進生長作用，而濃度增高則表現為抑制作用。Co2+的抑菌作用與大腸桿菌細胞壁通透性增大有關，而Sr2+、Cs+的抑菌作用通過金屬離子誘導細胞體內活性氧含量增大，從而抑制細菌生長。從宏觀層面反應了3種核素的金屬毒性，并從微觀層面進行了機理的探討，為后續研究鈷、銫、鍶等核素對生物體的致毒效應以及環境中核素的生物監測方法提供參考依據。

關鍵詞：Co;Sr;Cs;金屬毒性;大腸桿菌;活性氧含量;細胞壁通透性

隨著核技術在軍事、工農業、科研等領域的廣泛應用，由泄漏物質造成的放射性污染以及鈷、銫、鍶等金屬產生的金屬毒性對周邊水域的影響也引起了廣泛的關注[1]。我國核工業高速發展使得核電站的建設已經成為我國能源戰略中的一項重要議事，而內陸核電站的建設更是面臨著更嚴格的安全考量。由于內陸核電站受納水體容積小，一旦發生泄漏，將對周圍居民的生活帶來巨大的影響，因此為保證環境污染水平監測的可靠性，內陸核電站需要更多的科學評價標準[2]。同時由于磷酸鹽礦、煤礦、鐵礦等礦源經常伴隨著天然核素的存在，這些礦源的開采利用也將會對環境帶來污染[3]。核素通過擴散遷移流入到生態環境中，最終會對人類健康產生各種影響[4-5]，因此需要采取有效的手段進行污染檢測。生物監測可作為一項重要的手段，能夠更加客觀地評價內陸核電站在正常運行、事故工況以及退役過程中釋放的核素對環境產生的影響[6]。同時，隨著核能源的大力發展，核廢料的處理量也在逐年增長，而原料的開采以及廢料的處理，均不可避免地會對周圍環境造成一定的影響，尤其是像鈷、銫、鍶等核素，如何評價這些核素對環境的影響也成了當務之急。

作為自然界中數量最多、生物量最大、對生命元素循環具有最大影響的種群，在水體環境監測上，微生物具有得天獨厚的優勢[7]。低等微生物對環境中包括核素在內的金屬污染物、有機化合物等污染會表現得更加敏感，它們能夠最快地感受到生態系統中環境質量的變化，并通過相關機制做出反應。因此，微生物被認為是最有潛力的指示生物[8]。大腸桿菌是重要的微生物研究材料，也是重要的環境污染指示菌，以大腸桿菌為研究對象，能夠更普遍地反應核素泄漏對環境的影響，也能夠通過跟蹤污染區域的大腸桿菌生長情況來評估該區域的污染程度。

MTT（噻唑藍）比色法一般用于細胞活性檢測，利用雙波長法可以有效地去除包括死菌體、培養基在內的干擾物對試驗的影響[9]。傳統的平板計數工作量大，耗時長，與之相比，MTT法工作量小，操作快捷并且重復性高，已經廣泛應用于細胞毒性試驗。近年來MTT法也越來越多地應用于活菌數的測量，本試驗利用MTT法測量大腸桿菌的存活率，數據可靠且重復性高。

目前，在農藥等污染領域中，將微生物作為污染指示生物的相關研究已經取得了令人矚目的成就[10]。然而，在核素污染領域，選用微生物進行生物監測的研究鮮有報道。本試驗通過研究Co、Sr、Cs 3種核素外源添加對大腸桿菌生長速率的影響，定性反映核素對大腸桿菌的抑制作用，再利用MTT法定量檢測3種核素對大腸桿菌的半致死濃度，最后從細胞壁通透性變化以及氧化損傷2個方面研究鈷、銫、鍶3種金屬離子的致毒機理，為核電站泄漏污染物的生物監測提供相關參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coil-DH5α）：2017年6月購置于上海交通大學農業與生物學院，并于農業生物學院資源環境實驗室完成本試驗。

1.2 儀器

紫外分光光度計、實驗室高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養箱、振蕩渦旋器、水浴搖床、酶標儀、冷凍離心機、移液槍和超凈工作臺。

1.3 試劑

金屬離子均為氯化物：氯化鈷、氯化鍶、氯化銫。相關研究表明，不同陰離子對金屬離子的毒性有不同影響，在研究較為廣泛的Cl-、NO3-、OAc-這3種陰離子中，氯離子對金屬離子毒性影響較小[11]。其他試劑：MTT（噻唑藍）、二甲亞砜（DMSO）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、氯化鈉、活性氧ROS檢測試劑盒、堿式磷酸酶檢測試劑盒。

1.4 培養基

R2A液體培養基：胰蛋白胨0.25 g，酸水解酪蛋白 0.5 g，酵母浸粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.3 g，硫酸鎂0.1 g，丙酮酸鈉0.3 g，蛋白胨0.25 g，葡萄糖0.5 g，蒸餾水1 000 mL自然溶解，pH值為7.1～7.3。試驗前需要121 ℃高溫滅菌20 min。

1.5 試驗方法

1.5.1 濃度梯度培養基配制 反應體系總體積均為 100 mL，體系營養成分均為R2A液體培養基，加入適量金屬離子溶液，配制不同濃度梯度金屬離子液體培養基：Co2+液體培養基中Co2+濃度分別為0（對照組）、5、10、20、40 mg/L;Cs+液體培養基中銫離子濃度分別為0（對照組）、10 、100、1 000、2 000 mg/L;Sr2+液體培養基中Sr2+濃度分別為0（對照組）、10、100、1 000、2 000 mg/L。通過繪制各金屬離子脅迫下大腸桿菌的生長曲線，來確定最佳孵育時間以及后續試驗的濃度范圍。

MTT法定量測量核素的金屬毒性中，根據生長曲線判斷合適的離子濃度。此時的濃度梯度設置為Co2+液體培養基中Co2+濃度分別為0（對照組）、1、2.5、5、10、15、20 mg/L;Cs+液體培養基中Cs+濃度分別為0（對照組）、200、400、800、1 600、3 200 mg/L;Sr2+液體培養基中Sr2+濃度分別為0（對照組）、10、50、100、200、400、800、1 600 mg/L。每組設置3個平行樣。

磷酸酶活性、活性氧含量測量試驗組中各濃度梯度：Co2+液體培養基中Co2+濃度分別為0（對照組）、1、2、4、6、8、10 mg/L;Cs+液體培養基中Cs+濃度分別為0（對照組）、200、400、800、1 600、3 200 mg/L;Sr2+液體培養基中Sr2+濃度分別為0（對照組）、10、50、100、150、200、250 mg/L。每組設置3個平行樣。

1.5.2 大腸桿菌生長曲線繪制 從細菌平板上挑選長勢良好的細菌接種至100 mL R2A液體培養基中，恒溫水浴（37 ℃）振蕩培養24 h，復蘇細菌待用。

按照1 ∶ 100的接種比例，從已復蘇的菌液中吸取1 mL接入盛有100 mL各濃度梯度Co2+液體培養基的三角瓶中，振蕩混合均勻后分裝至具塞試管，每試管分裝5 mL，封口，置于37 ℃恒溫水浴振蕩培養。每隔1 h左右取出1組試管，測量其在600 nm波長下的吸光度。氯化鍶、氯化銫試驗組除培養基配制不同外其余操作相同。

1.5.3 MTT法檢測大腸桿菌在3種核素影響下的存活率 噻唑藍[3-3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，簡稱MTT]法是常用于檢測細胞存活的一種方法，其原理是活細胞中琥珀酸脫氫酶能夠還原外源性MTT為不溶于水的藍色晶體甲瓚（formazan），通過二甲亞砜溶解甲瓚，測量溶液在特定波長下的吸光度，間接反映細胞存活數量。

稱取250 mg MTT溶于50 mL PBS緩沖溶液（0.01 mol/L，pH=7.2），振蕩使其充分溶解，使用微孔過濾器除菌，鋁箔包好放置于-20 ℃下冷凍待用。按照濃度梯度設置配制氯化鈷液體培養基并接種活化的大腸桿菌，水浴振蕩培養4 h。

孵育培養4 h后于試管中吸取1 mL菌液至1.5 mL EP管中，加入200 μL 5 mg/mL MTT溶液，振蕩搖勻，避光放置于37 ℃生化培養箱中，繼續孵育1 h。

孵育完成后取出EP管，放入高速冷凍離心機12 000 g離心10 min，小心吸去上清液，加入1 mL二甲亞砜溶液，振蕩搖勻后將混合液鋪至96孔板，每孔200微升并設置復孔，酶標儀檢測510 nm以及690 nm波長下的吸光度。Co2+、Sr2+、Cs+試驗組操作除培養基配制外均相同。

1.5.4 大腸桿菌在3種核素影響下的堿式磷酸酶活性測量 按照濃度梯度要求配制100 mL R2A液體培養基，同時接種1 mL新鮮菌液至培養基中，水浴振蕩孵育4 h。完成孵育培養后取菌液于12 000 g加速度條件下離心10 min，并按照堿性磷酸酶試劑盒說明書要求，取0.05 mL樣本加入0.5 mL PBS緩沖液，37 ℃水浴振蕩15 min，加入顯色劑 1.5 mL，并在520 nm條件下進行吸光度測量，通過公式轉換得到堿性磷酸酶活性。每組試驗重復3次。

1.5.5 大腸桿菌在3種核素影響下的活性氧含量測量 按照“1.5.4”節中方法制取不同試驗樣本并離心取菌體，在加速度為12 000 g的條件下離心樣本10 min，小心吸去上清液并用生理鹽水充分洗滌細菌菌體，按照活性氧（ROS）試劑盒說明書要求，測試其活性氧含量。加入DCFH-DA（2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽）于上述菌體中，并保證工作濃度為 10 μmol/L，37 ℃孵育細胞30 min，12 000 g離心10 min，收集細菌菌體，并用PBS緩沖液洗滌2次，在次離心收集菌體用于熒光檢測。設置激發波長為550 nm，發射波長為525 nm，用于熒光強度檢測，每組試驗重復3次。

1.5.6 大腸桿菌在3種核素影響下的蛋白質含量測量 按照“1.5.4”節中方法制取不同試驗樣本。12 000 g離心 10 min，生理鹽水充分洗滌，取菌體溶于1 mL細菌裂解液。按照總蛋白定量試劑盒要求方法測定樣本中總蛋白的含量。

2 結果與分析

2.1 3種核素脅迫作用對大腸桿菌生長速率的影響

由圖1可知，孵育2 h內大腸桿菌在新的培養環境中處于適應期，其生長速度較為緩慢，隨后的7 h內處于生長對數期。在接觸培養前期，10 mg/L的Cs+濃度對大腸桿菌損傷作用較小，但隨著接觸培養時間的延長，10 mg/L試驗組中的生長曲線與對照組的差異逐漸增大，說明Cs+對大腸桿菌生長的影響作用會隨接觸時間的延長逐漸增強。在培養5 h后，10、100 mg/L試驗組的吸光度與對照組相比下降8%、11%，而1 000、2 000 m/L試驗組與對照組相比分別下降了31%、45%。可以看出，Cs+對大腸桿菌生長主要表現為抑制作用，且隨著劑量的增加，抑制作用逐漸增強;隨著培養接觸時間延長，其抑制作用也在逐漸增強。

由圖2可知，Sr2+對大腸桿菌的作用具有雙向性，主要表現在低濃度（10 mg/L）Sr2+下，大腸桿菌的生長比較迅速并且超過對照組，而隨著Sr2+濃度的增加，濃度大于等于 100 mg/L 后，大腸桿菌生長變緩、數量越來越少。培養4 h后，與對照組相比，100 mg/L Sr2+濃度的培養基中，大腸桿菌菌液D600 nm值下降25%，1 000 mg/L Sr2+濃度試驗組D600 nm值下降42%。可以看出，與Cs+培養條件相比，添加Sr2+培養基中大腸桿菌的生長更緩慢;同時，在1 000、2 000 mg/L高濃度試驗組中大腸桿菌出現了提前進入衰亡期的現象，即接觸反應7 h后，低濃度試驗組的大腸桿菌還處于對數期，而高濃度試驗組大腸桿菌已經進入衰亡期。

由圖3可知，5 mg/L Co2+對大腸桿菌的生長產生了明顯影響，其生長數量明顯低于對照組，且20、40 mg/L試驗組中大腸桿菌幾乎無法生長。在培養5 h后，與對照組相比，5、10 mg/L 試驗組中大腸桿菌D600 nm值分別下降58%、91%，高濃度Co2+（>20 mg/L）培養條件下大腸桿菌基本無法生長。

2.2 MTT法檢測3種核素離子對大腸桿菌毒害性

2.2.1 不同濃度Co2+對大腸桿菌生長情況的影響 由圖4可知，在Co2+濃度為10 mg/L時大腸桿菌的死亡率已經達到93.2%，而當Co2+濃度增加至20 mg/L時可以使98%以上的大腸桿菌死亡。對濃度取對數，繪制大腸桿菌生長抑制效應曲線，并通過直線擬合發現Co2+濃度與大腸桿菌生長抑制率呈現高度的線性關系，通過濃度擬合直線可以估算出Co2+對大腸桿菌的半致死效應劑量約為3.38 mg/L。

2.2.2 不同濃度Cs+對大腸桿菌生長情況的影響 如圖5所示，隨著Cs+濃度增高大腸桿菌的存活率逐漸減小。觀察曲線發現當Cs+濃度在1 500 mg/L以下時，隨著Cs+濃度升高大腸桿菌的死亡率迅速增大，但當Cs+濃度高于 1 500 mg/L 后，大腸桿菌死亡率的增長逐漸趨于平緩。對濃度取對數，使其為橫坐標， 繪制Cs+的抑菌效應曲線， 擬合可得到Cs+對大腸桿菌的半致死率濃度約為1 600 mg/L。

2.2.3 不同濃度Sr2+對大腸桿菌生長情況的影響 由圖6可知，在10 mg/L Sr2+濃度劑量下，大腸桿菌的死亡率為負值，說明其生長狀況優于對照組。而隨著Sr2+濃度繼續提高，大腸桿菌的存活率逐漸減小，取濃度對數為橫坐標繪制抑制曲線，通過直線擬合可以發現，當Sr2+濃度為13 mg/L時，Sr2+對大腸桿菌生長情況與對照組基本持平，其生長情況與對照組相同，隨著Sr2+濃度的增加，大腸桿菌的生長受到明顯抑制，當Sr2+濃度達到100 mg/L時，大腸桿菌生長抑制率為40%。當Sr2+濃度超過200 mg/L后，隨著Sr2+濃度提高大腸桿菌生長抑制率的增幅逐漸減緩，當濃度達到400 mg/L時抑制作用達到最大，隨后抑制作用存在但隨著劑量的增大而開始減小。取濃度對數為橫坐標，對Sr2+濃度為0～400 mg/L時的大腸桿菌生長抑制率進行擬合，可估算Sr2+對大腸桿菌生長半致死量約為251 mg/L。在試驗階段發現，當Sr2+濃度超過400 mg/L后，培養液中出現了肉眼可見的渾濁，并且隨著氯化鍶配制濃度的增加，渾濁度呈現增加的趨勢。這可能是由于培養基中的營養物質與Sr2+形成部分沉淀，降低了溶液中游離態Sr2+的存在，削弱了氯化鍶對大腸桿菌的毒害作用。

2.3 3種核素離子對大腸桿菌堿性磷酸酶活性的影響

由圖7可知，在1、2、4 mg/L Co2+濃度處理下，大腸桿菌胞外菌液中的堿式磷酸酶活性稍有增強，由0.11 U/L增加到0.17 U/L，增幅約50%。隨著Co2+濃度從4 mg/L增大至 10 mg/L， 大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性由0.17 U/L增大至0.79 U/L，酶活性提高約4倍。由圖8可知，在0～800 mg/L Cs+濃度下，大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性也出現提升，其活力由0.29 U/L上升至0.47 U/L，但當Cs+濃度大于 800 mg/L 時，其胞外堿式磷酸酶活力基本不變。Sr2+對大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性的影響較小，在0～50 mg/L Sr2+濃度范圍內，大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性由0.26 U/L上升到0.33 U/L，隨后隨著Sr2+濃度的升高，其胞外堿式磷酸酶活性小幅波動，平均保持在0.33 U/L左右（圖9）。

2.4 3種核素離子對大腸桿菌菌體活性氧含量的影響

圖10顯示，在Co2+的作用下，大腸桿菌菌體活性氧含量隨著Co2+濃度升高呈現先緩慢增高后緩慢減弱的趨勢，與對照組相比，其相對熒光強度沒有明顯變化。而在Cs+、Sr2+的影響下，隨著金屬離子濃度的增加，大腸桿菌活性氧含量快速上升。由圖11可知，與對照組相比，400 mg/L Cs+濃度下，活性氧含量升高9.7%，1 600 mg/L Cs+濃度下活性氧含量升高74%，結合大腸桿菌在Cs+培養基中的存活率可以看出，Cs+的抑菌效應與活性氧含量可能存在正相關關系。由圖12可知， 與對照組相比， 10 mg/L Sr2+濃度下， 活性氧含量相對減

少4.7%，隨后增加Sr2+濃度，活性氧含量隨之上升;其中，與對照組相比，50 mg/L試驗組中活性氧含量上升14.7%，200 mg/L 試驗組中活性氧含量上升55.1%，此時繼續增加Sr2+濃度，活性氧含量的增加量基本趨于平緩，與大腸桿菌在Sr2+作用下的存活率可能存在一定的正相關關系。

3 討論與結論

目前在環境污染物生物監測方向，主要監測污染物為Pb2+、Ag+、Hg+、Cd2+、Cu2+、Zn2+，相關研究表明急性毒性由強到弱依次為Cd2+>Cu2+>Zn2+[12]。本試驗以核電站的泄漏污染檢測為出發點，主要研究Co2+、Cs+、Sr2+ 3種穩定核素對大腸桿菌的影響，后續通過MTT法定量研究了大腸桿菌在3種核素下的抑制效應，反映了Co2+、Cs+、Sr2+ 3種核電站常見污染物對環境的毒性。

研究發現，Co2+的毒性最強，在濃度為10 mg/L即可對大腸桿菌造成明顯的毒害作用，能夠抑制90%以上細菌生長，徐芳芳的研究表明Co2+濃度在11 mg/L時已經具有明顯的抑菌作用[13]，本試驗結果與之相符。而Cs+的毒性最小，Sr2+則表現出了雙向性，在10 mg/L濃度下對大腸桿菌的生長表現了促進作用，隨著濃度增高，促進作用削弱抑制作用增強，在400 mg/L時抑制作用最大，為48%。近年來有許多關于Sr2+對植物生長影響的報道，大多數研究成果表明，低濃度的Sr2+促進植物生長而高濃度的鍶抑制植物生長[14-15]，本試驗中鍶對大腸桿菌生長作用與之類似。Cs+比Sr2+、Co2+對大腸桿菌的毒性稍小，500 mg/L Cs+對大腸桿菌生長抑制率低于20%。董新姣等通過最小抑菌濃度反映重金屬對大腸桿菌的毒性，發現Hg+（1 mg/L）>Cd2+（50 mg/L），Pb2+（50 mg/L）>Cu2+（100 mg/L）>Zn2+（200 mg/L）[16]。由此可以得出，Co2+對大腸桿菌毒性較強，介于Hg+與Pb2+之間，而Sr2+、Cs+毒性較小。

金屬離子對細菌的毒害表現為多方面聯合作用。Avery等研究發現，Sr2+能夠改變酵母菌的細胞壁通透性[17]。細菌細胞壁具有抑制機械和滲透損傷的作用，能夠保持細胞外形，阻止大分子入侵。堿性磷酸酶主要存在于細菌的細胞壁與細胞膜之間，正常情況下細菌的培養液中檢測不到堿性磷酸酶的存在[18-19]。侯偉峰等通過測定菌液堿式磷酸酶活性，結合電導率的測定反映了植酸對大腸桿菌細胞壁的損壞情況[20]。Sun等研究結果證實，Al3+的脅迫作用能改變植物細胞壁的通透性，致使磷酸酶外泄[21]。碳酸鹽礦物中的陽離子主要包括鈣、鎂、鐵、銅等元素。陳武研究表明，碳酸鹽礦物與大腸桿菌作用后堿性磷酸酶大量溢出，并通過電鏡掃描證明了這種堿性磷酸酶的溢出源自于大腸桿菌細胞壁被破壞后通透性增大導致[22]。本試驗中，在Co2+作用下，大腸桿菌胞外堿性磷酸酶活性隨著Co2+濃度增加迅速上升，表明Co2+對大腸桿菌的細胞壁具有破壞作用，使得大腸桿菌的細胞壁通透性增加，繼而在胞外出現大量AKP。可以推測Co2+對大腸桿菌的至毒機理可能是破壞細胞壁完整性，使細菌內環境的穩定性受到破壞，從而抑制細菌生長。Cs+、Sr2+試驗組中大腸桿菌胞外堿式磷酸酶活性變化不大，其抑菌作用與細胞壁的通透性完整性變化相關性不大。

金屬離子對微生物的毒性還體現在氧化損傷層面，研究表明金屬離子會誘導活性氧的產生，通過線粒體呼吸鏈引起細胞氧化應激，導致氧化損傷[23]。金屬離子也能抑制抗氧化酶系統，從而對細胞造成不可逆的損傷[24]。馮德玉等在油菜對鍶脅迫的生理生態響應中發現，Sr2+對細胞同樣具有氧化損傷作用，在Sr2+脅迫作用下其氧化損傷作用增強，POD酶和SOD酶等抗氧化系統酶活性都出現了增高的現象[25]。本試驗中在Co2+試驗組中發現各組樣本中活性氧含量隨著Co2+濃度上升出現了先升后降的現象，但其變化幅度均在10%之內。而Cs+、Sr2+試驗組中活性氧含量檢測結果表明，外源添加的Cs+和Sr2+這2種金屬離子明顯提高了大腸桿菌菌體內部活性氧含量，結合2種離子培養下的抑菌率可以推測Cs+與Sr2+對大腸桿菌的致毒效應與其活性氧含量的積累有關。

本試驗結果表明，Co2+對大腸桿菌半致死濃度約為 3.38 mg/L，Sr2+對大腸桿菌半致死濃度約為251 mg/L，Cs+對大腸桿菌半致死濃度約為1 600 mg/L。Sr2+對大腸桿菌生長影響表現了雙向性，即低濃度（小于10 mgL）是表現為刺激生長，而高濃度下表現為抑制生長。Co2+的脅迫作用使大腸桿菌壁膜通透性發生改變造成堿性磷酸酶出現大量泄漏，表明Co2+毒性機理與其改變細胞壁膜通透性有關。Cs+與Sr2+的毒性與氧化損傷有關，離子誘導胞內活性氧的積累，達到了抑菌作用。

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