成都地區犬細小病毒分子流行病學調查

陳小蓉 楊寧 張燕紅 黃堅 楊曉農*

（1，西南民族大學生命科學與技術學院 610041； 2，四川省宣漢縣農業局 636150； 3，鐵騎力士集團 621006）

犬細小病毒病是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種以出血性腸炎、非化膿性心肌炎和白細胞顯著減少為主要特征的高度接觸性、致死性、急性傳染病[1,2]。不同年齡、性別、品種的犬均可感染該病，但以剛斷奶至90日齡的犬最易感，病情也較嚴重。由于疫苗免疫或自然感染，成年犬是獲得免疫的，而哺乳仔犬可通過乳汁獲得母源抗體[3]，因此，哺乳仔犬和成年犬極少發病。

CPV 最先由美國的Eugster 于1977年通過電鏡觀察到[4]，隨后被澳大利亞的Kelly 和加拿大的Thomson [5]同時從患腸炎的病犬分離獲得。CPV 對外界環境有很強的抵抗力，加之易感動物又對其極敏感，因此，CPV 在出現后的很短時間內就在全球范圍內廣泛傳播。由于不同國家或同一國家不同地區的免疫意識不同，因此，在不同國家或同一國家不同地區CPV 的流行情況有所區別。據報道，近年來，我國青島地區[6]、田東縣[7]、牡丹江地區[8]、河南地區 [9]的CPV 陽性檢出率分別為11.03%、74.90%、50.00%、88.48%。而成都地區近幾年沒有CPV 流行情況的相關報道。本調查采用一步法實時熒光PCR 對采自成都地區6 家動物醫院的145 份具有腹瀉癥狀犬的糞便棉拭子樣品進行CPV檢測。了解成都地區CPV 的流行情況，為成都地區CPV 的防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備

臺式高速冷凍離心機（H2050R，長沙湘儀離心機儀器有限公司）； 熒光定量96 孔PCR 儀（FQD-96A，杭州博日科技有限公司）； 全自動高壓滅菌鍋（GR60DA，致微（廈門）儀器有限公司）； 潔凈工作臺（SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術有限公司）； -80℃超低溫冰箱（DW-86L828J，青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 主要試劑與耗材

POCKIT 細小病毒檢測套組（包含：dNTPs，引物，探針，酶和CPV 陽性模板），購置于廈門金瑞（鴻捷）生物科技有限公司（批號：020717），該套組具有良好的靈敏度、特異性、重復性，可直接用于實時熒光PCR 檢測； 天恩澤柱式病毒DNAout 試劑盒，購置于北京天恩澤基因科技有限公司（批號：217059hgz）。

1.3 糞便樣品的采集與處理

2016年9月至2017年9月在成都市6 家動物醫院采集具有腹瀉癥狀的犬糞便棉拭子樣品共145 份。在潔凈工作臺中，將加有雙抗的DMEM 按4ml 每份分裝于5ml 滅菌EP 管中，于4℃保存備用。采樣時將無菌棉簽輕輕旋轉插入具有腹瀉癥狀的犬肛門內，停留片刻后輕輕取出，放入裝有DMEM 的EP 管中，并使棉簽頭完全浸入DMEM 中，于-20℃暫時保存； 樣品至實驗室后，于-80℃保存備用。

1.4 糞便樣品病毒核酸的提取

按照天恩澤柱式病毒DNAout 試劑盒的說明書提取糞便樣品病毒核酸，提取完后于-20℃保存備用。

1.5 糞便樣品的CPV檢測

按照POCKIT 細小病毒檢測套組的說明書配置PCR 試劑，并建立以下25μlPCR 反應體系：2μlNDA 模板，23μl 回溶好的Premix。按照上述PCR 反應體系，利用熒光定量96 孔PCR 儀進行CPV檢測。一步法實時熒光PCR 反應條件為：93℃20s，1個循環； 93℃15s，60℃1min，40 個循環。

1.6 統計分析

根據采樣記錄和檢測結果，分別計算不同性別、不同年齡、不同品種、不同免疫狀況犬的CPV檢出率及不同季節CPV的檢出率，然后使用SPSS （IBM SPSS Statistics 21.0），用χ2檢驗各檢出率之間的差異性。＜0.01 為差異極顯著；＜0.05 為差異顯著；＞0.05 為差異不顯著。若兩個檢出率間的差異極顯著則其肩標為不同大寫字母； 若兩個檢出率間的差異顯著則其肩標為不同小寫字母； 若兩個檢出率間差異不顯著則其肩標為相同小寫字母。

2 結果

2.1 糞便樣品的CPV檢測結果

145 份樣品中有120 份出現CPV 特異性擴增曲線，CPV 的陽性檢出率為82.76%，部分擴增曲線見附圖。

附圖 一步法實時熒光PCR 擴增曲線

2.2 不同性別犬的CPV檢出率

不同性別犬的CPV檢出率見表1。χ2檢驗顯示，不同性別犬的CPV檢出率間差異不顯著（＞0.05），表明CPV 的檢出率與犬的性別無關。

表1 不同性別犬CPV 的檢出率

2.3 不同年齡犬的CPV檢出率

不同年齡犬的CPV檢出率見表2。χ2檢驗顯示，不同年齡犬的CPV檢出率間差異極顯著（＜0.01），表明CPV 的檢出率與犬的年齡有關。其中1～3月齡犬的CPV檢出率最高，為93.15%，其與4～8月齡犬的CPV檢出率差異極顯著（＜0.01），與9～12月齡犬的CPV檢出率差異顯著（＜0.05），與1 歲以上犬的CPV檢出率差異不顯著（＞0.05）。4～8月齡犬的CPV檢出率、9～12月齡犬的CPV檢出率及1 歲以上犬的CPV檢出率間差異不顯著（＞0.05）。

表2 不同年齡犬CPV 的檢出率

2.4 不同品種犬的CPV檢出率

不同品種犬的CPV 的檢出率見表3。χ2檢驗顯示，不同品種犬的CPV檢出率間差異極顯著（＜0.01），表明CPV 的檢出率與犬的品種有關。純種犬的CPV檢出率比雜種犬的CPV檢出率高。純種犬的CPV檢出率為88.62%，雜種犬的CPV 的檢出率為50.00%。

表3 不同品種犬CPV 的檢出率

2.5 不同免疫情況犬的CPV檢出率

不同免疫狀態犬的CPV檢出率見表4。χ2檢驗顯示，不同免疫情況犬的CPV檢出率間差異極顯著（＜0.01），表明CPV的檢出率與犬的免疫情況有關。未免疫犬的CPV檢出率明顯高于已免疫犬。未免疫犬的CPV檢出率為97.06%，已免疫犬的CPV 的檢出率為48.84%。

表4 不同免疫狀態犬CPV 的檢出率

2.6 不同季節CPV 的檢出率

不同季節CPV 的檢出率見表5。χ2檢驗顯示，不同季節CPV 的檢出率間差異顯著（＜0.05），表明CPV 的檢出率與季節有關。春季CPV 的檢出率最高，為90.38%，其與夏季CPV的檢出率差異顯著（＜0.05），與秋季以及冬季CPV 的檢出率差異不顯著（＞0.05）。夏季CPV 的檢出率與秋季CPV 的檢出率差異不顯著（＞0.05），與冬季CPV 的檢出率差異顯著（＜0.05）。秋季CPV 的檢出率和冬季CPV 的檢出率差異不顯著（＞0.05）。

表5 不同季節CPV 的檢出率

3 討論

本研究對采自成都市的145 份糞便樣品進行CPV檢測，檢出率為82.76%，該結果明顯高于河南省部分地區[10]、泰州[11]、鄭州 [12]等地的調查結果，這可能與所采用的檢測方法及調查對象有關，本調查采用靈敏度高的實時熒光PCR 對具有腹瀉癥狀的就診犬進行檢測，而其他地區采用靈敏度較低的CPV 膠體金快速診斷試紙條對所有就診犬進行檢測； 該結果略低于2011～2013年河南省 [9]的調查結果，這可能與不同地區人們的免疫接種意識有關。據調查發現，公母犬均可感染CPV 且公犬的檢出率略高于母犬，但經統計學分析發現，犬的CPV檢出率與犬的性別無關（＞0.05），這與酒泉地區的報道 [13]一致； 犬CPV 的檢出率與犬年齡有關（＜0.01），其中1～3月齡犬的CPV檢出率最高，其次為4～8月齡犬，1 歲以上犬的CPV檢出率最低，這可能是由于仔犬在斷乳前受到母源抗體的保護，而斷奶后母源抗體水平逐漸下降，如果此時未對其進行免疫接種，其對外界的抵抗力變低易被CPV 感染，而成年犬一般為CPV 獲得性免疫，不易被CPV 感染，在平時飼養管理中應聽從獸醫等專業人員的建議，認真做好免疫接種工作，增強犬只的免疫力； 純種犬的CPV檢出率較雜種犬高，這與昌吉[14]、蘇州[15]的報道一致，這可能與雜種犬較強的適應力和抵抗力有關； 未免疫犬的CPV檢出率高于已免疫犬，這提示免疫接種可有效地預防CPV，因此，畜主應按時對犬只進行免疫接種； 犬一年四季均可感染CPV，但春季的檢出率最高，這與河南[10]、烏蘭察布 [16]的調查結果相一致，究其原因可能是由于春季冷暖空氣交匯，天氣多變忽冷忽熱，犬自身的抗病能力隨之下降，加之病毒在春季容易生長繁殖，所以犬易被CPV 感染，因此，在春季應做好飼養管理工作，以提高犬只自身的抵抗力，盡量選擇比較好的天氣遛狗，從而減少被病原感染的機會。

綜上所述，該研究了解了成都地區CPV 的流行情況，豐富了成都地區犬CPV 的流行病學資料，為該地區犬的CPV 診斷及防控提供基本數據。