電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定骨軟骨一體支架中鈣元素含量不確定度分析*

孫小莉 湯曉陽 王冬梅 吳 建 劉 東 劉向輝

因創(chuàng)傷、炎癥、退變、腫瘤切除等疾病引起的關(guān)節(jié)軟骨病變或骨軟骨聯(lián)合病變是骨科常見的疾病[1].關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管組織,軟骨細(xì)胞主要依靠關(guān)節(jié)滑液及細(xì)胞周圍基質(zhì)以無氧酵解供給營養(yǎng),其自身修復(fù)能力有限,如何促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù),并重建關(guān)節(jié)功能是臨床難題之一[2].隨著軟骨組織工程學(xué)的發(fā)展,制備可降解、無毒性的生物支架材料,并接種種子細(xì)胞制備組織工程軟骨來修復(fù)軟骨缺損,是一種創(chuàng)傷小、不良反應(yīng)少且簡便實(shí)用的修復(fù)方法[3-4].

目前,利用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建工程化軟骨修復(fù)、軟骨缺損的支架產(chǎn)品已經(jīng)批準(zhǔn)可用于臨床,其中包括殼聚糖支架[5-6]、膠原膜支架[7-9]、透明質(zhì)酸支架[10-11]以及PVA支架等[12-13].組織工程軟骨修復(fù)軟骨缺損取得了巨大的進(jìn)展,但仍然存在難以固定以及與周圍宿主軟骨或骨整合不良的問題[14].骨軟骨一體支架中鈣的含量間接地反映了骨軟骨一體支架的力學(xué)性能,影響支架的修復(fù)性能和使用壽命,因此對骨軟骨一體支架中鈣元素的含量進(jìn)行測定很有必要.為此,本研究通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry,ICP-AES)測定骨軟骨一體支架中鈣元素的含量,并根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059.1-2012)[15]的要求進(jìn)行不確定度分析,為評定檢測結(jié)果的可靠程度提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Optima 7000DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)(美國PerkinElmer公司);XP205DR型分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);CEM MARS6型微波消解儀(美國Pynnco公司);EG-20B型全防腐電熱板(廣州基創(chuàng)儀器有限公司);Ca標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mg/L(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究院);UP級濃HNO3(蘇州晶瑞化學(xué)有限公司);UP級濃氫氟酸(蘇州晶瑞化學(xué)有限公司);UP級濃高氯酸(蘇州晶瑞化學(xué)有限公司);Milli-Q超純水(美國Millipore公司)作為實(shí)驗(yàn)用水.

1.2 試驗(yàn)方法

以兔脫細(xì)胞松質(zhì)骨為骨軟骨層組織工程一體支架的硬骨層,以兔軟骨細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合絲素蛋白為軟骨層,采用冷凍-干燥法制備的一體支架,由天然骨軟骨脫細(xì)胞材料和與天然生物材料相似的生物材料制成,生物相容性好,可作為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨病變或骨軟骨聯(lián)合病變的醫(yī)用材料.

1.2.1 樣品檢驗(yàn)液制備

精密稱取約0.2 g(精確至0.0001 g)樣品,于聚四氟乙烯消解罐中,分別加入硝酸(HNO3)4 ml,氫氟酸(HF)2 ml,置于電熱板上120 ℃預(yù)消解30 min后冷卻至室溫25 ℃,將消解罐轉(zhuǎn)移至微波消解儀中進(jìn)行消解.微波消解程序設(shè)定5 min內(nèi)溫度達(dá)到200 ℃,保持10 min,然后10 min冷卻至室溫25 ℃,然后將消解液轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中用超純水定容至刻度,搖勻,待測.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

依次在6個100 ml容量瓶中加入0.0 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml和2.0 ml鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000 mg/L),用超純水對其進(jìn)行稀釋并定容,搖勻,待測.

1.2.3 儀器參數(shù)

實(shí)驗(yàn)用儀器為Optima 7000DV型ICP-OES.工作條件參數(shù):入射功率為1.5 kW, 氬氣流量15 L/min,載氣流量0.25 L/min,輔助氣0.20 L/min,霧化器流量0.8 ml/min,沖洗時間為1 min,等離子炬點(diǎn)火60 min后進(jìn)行試驗(yàn).于儀器自動進(jìn)樣器上放置標(biāo)樣和樣品,選取干擾較少的422.673 nm分析波長進(jìn)行測定.

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的建立

鈣含量的計算為公式1:

式中X為試樣中鈣含量(mg/g);C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到鈣的質(zhì)量濃度(mg/L);v為樣品定容體積(ml);m為樣品取樣量(g).

鈣檢測是采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,試樣測定結(jié)果的不確定度除濃度(C)、體積(V)及質(zhì)量(m)外, 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及試樣測量重復(fù)性都對測定結(jié)果產(chǎn)生影響,則公式1可轉(zhuǎn)化為公式2:

式中R為回收率,f重為重復(fù)性修正因子,f校為校正曲線擬合修正因子.

2 不確定度結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

從測量過程和數(shù)學(xué)模型分析, 試樣測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel(C)、試樣稱量引入的不確定度urel(m)、試樣定容引入的不確定度urel(v)、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(C0)、重復(fù)條件下測量引入的不確定度urel()以及儀器引入的不確定度urel()等方面引入[16].

2.2 各分量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

(1)標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度urel(C1).使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液來自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究院,證書中給出的鈣濃度為1000 mg/L,相對不確定度為:urel(C1)=0.5%.

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度urel(C2).用超純水將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為0.0、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L和20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液.配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作液所用的量具見表1.經(jīng)過查看檢定證書,得所采用100 μl、1 ml和5 ml移液槍給定的允差分別為±0.005 ml、±0.01 ml和±0.03 ml.如果按均勻分布進(jìn)行分析,則標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別如下:

配制標(biāo)準(zhǔn)工作液時移液器的相對不確定度見表1.

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列配制過程中移液器校準(zhǔn)引起的不確定度

根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)合成配制標(biāo)準(zhǔn)工作液時移液器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液使用了6個100 ml容量瓶,以單個100 ml容量瓶為例,20 ℃時,(A級)100 ml容量瓶的容量允差[17]為±0.1 ml,依據(jù)三角分布考慮,則100 ml容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

依據(jù)公式對其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行分析:

標(biāo)準(zhǔn)工作液所采用的溶劑為超純水配制而成,20 ℃時玻璃的體積膨脹系數(shù)為2.5X10-5/℃[17];水的體積膨脹系數(shù)為2.1X10-4/℃[18].假定標(biāo)準(zhǔn)稀釋時所采用的100 ml容量瓶的使用溫度與室溫一致, 則使用溫度(實(shí)驗(yàn)時室溫為23.5 ℃)引起的體積不確定度值為:

按三角分布考慮, 此實(shí)驗(yàn)溫度下所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

依據(jù)公式對其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行計算后為:

合成標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.2 試樣稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

待測試樣同樣使用十萬分之一天平進(jìn)行稱量, 根據(jù)電子天平檢定證書, 在d=0.1 mg、0≤m≤50 g條件下, 其最大允許誤差為±0.5 mg, 按矩形分布考慮,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

稱取試樣0.2003 g,其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.3 試樣制備過程中的定容操作引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v)

使用100~5000 μl移液器移取1.2 ml超純水定容至50 ml,查檢定證書,得到給定的允差為±0.03 ml.按均勻分布處理,則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C0)

將6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別上機(jī)檢測6次, 測得的峰面積結(jié)果見表2.通過線性擬合,鈣元素標(biāo)準(zhǔn)曲線在被測范圍0~20 mg/L內(nèi)回歸方程和相關(guān)系數(shù)依次為:y=3841.8x-68.553,相關(guān)系數(shù)r=0.9999;標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為217.42;標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)見表2.

其中

應(yīng)用該曲線進(jìn)行測量時, 對被測試樣檢測10次,即p=10, 測得試樣中鈣的濃度見表3.

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)

表3 試樣液中鈣濃度測量結(jié)果

表4 試樣重復(fù)性測量結(jié)果

由表3計算得出試樣中鈣的平均濃度為12.34 mg/L,試樣質(zhì)量為0.2003 g,按公式(1)得到的試樣中鈣的最佳估計值為3.08 mg/g.

校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

式中S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差, 數(shù)值為217.42;b為校準(zhǔn)曲線的斜率數(shù)值為3841.8;p為試樣測定次數(shù),數(shù)值為10;n為校準(zhǔn)溶液的測定次數(shù),數(shù)值為30;Sxx為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和,數(shù)值為1446.67;為試樣中鈣的平均濃度, 數(shù)值為12.34 mg/L;為鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度, 數(shù)值為6.33 mg/L.

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.5 試樣測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

對12.34 mg/L濃度的試樣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加后平行測定10次, 添加標(biāo)準(zhǔn)量為2.0 mg/L,所得結(jié)果見表4.

經(jīng)計算,10次平行測定結(jié)果的平均回收率(R)為:

根據(jù)貝塞爾公式,單個測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

試樣測定平均值的A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

對平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)[15-16].顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn),當(dāng)檢驗(yàn)值t大于或等于臨界值t(95,9)=2.26[15-16]時,則R于100%有顯著性差異,表明必須考慮校準(zhǔn)因子f重,用于修正結(jié)果,否則不采用.

實(shí)驗(yàn)中t值為:其值為小于臨界值2.23,在計算公式中可忽略校準(zhǔn)因子f重[15-16].試樣測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel()=0.00605.

2.2.6 ICP-AES儀器引入的不確定度urel(Q)

實(shí)驗(yàn)使用的儀器為美國PerkinElmer公司Optima 7000DV型ICP-AES,標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.5%,取k=2.故由儀器ICP-AES引起的不確定度為(Q)=0.5%/2=0.0025.

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

根據(jù)各分量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定[15-16]合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

試樣中鈣含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.144 mg/g.

2.4 擴(kuò)展不確定度的評定

擴(kuò)展不確定度由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子得到, 取置信水平95%,則k=2,骨軟骨一體支架中鈣含量的擴(kuò)展不確定度為:

通過對骨軟骨一體支架中鈣含量的不確定度分析,當(dāng)取樣量為0.2003 g,取置信水平95%,k=2,測得骨軟骨一體支架中鈣含量為(3.08±0.288)mg/g.

3 結(jié)論

使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法對骨軟骨一體支架中鈣含量進(jìn)行的測定,并通過對骨軟骨一體支架中鈣的不確定度的分析,得出主要不確定度來源為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、試樣制備過程中的定容操作.為進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,在檢驗(yàn)檢測過程中應(yīng)提高標(biāo)準(zhǔn)品純度以及使用精確的移液器.