血清基質金屬蛋白酶-3檢測試劑盒用于MODULAR P800型全自動生化分析儀中的性能評價

鄧玲艷 岳道遠 李輝軍*

基質金屬蛋白酶是一組鋅離子依賴性的蛋白水解酶家族,是細胞外基質(extracellular matrix,ECM)降解及重構的重要介質,在人類至少25種已被識別和定性,其中以基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)最為重要[1-3].MMP-3主要產生于滑膜細胞和軟骨細胞,其特異性基質是構成軟骨的蛋白多糖,已有許多文獻報道MMP-3與類風濕關節炎(RA)的發生、發展及預后密切相關[4-9].

目前,基于全自動生化分析儀器的MMP-3定量檢測試劑盒可應用于臨床檢測.2006年原國家衛生部頒布的《醫療機構臨床實驗室管理辦法》中明確要求,臨床實驗室在某一檢測項目正式用來檢測患者標本、發出檢驗報告前,實驗室需對其相關方法學分析性能進行評價.為此,本研究根據文獻和國內外標準和指南的要求,評價積水公司的MMP-3定量檢測試劑盒在實驗室使用MODULAR P800型全自動生化分析系統的性能.

1 資料與方法

1.1 標本來源

采集2016年1-10月間華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院的130名表觀健康體檢者血清標本,其中男性和女性各65名.

1.2 儀器與試劑

羅氏MODULAR P800型全自動生化分析儀(瑞士Roche公司);MMP-3定量檢測試劑盒及配套校準品、質控品(日本積水公司);干擾物A-PLUS(日本SYSMEX公司).

1.3 實驗方法

全自動生化分析儀在性能評價前均按制造商要求經過功能校準,各項性能指標符合儀器廠商申明的性能要求,每日按指定的標準化操作程序進行維護保養和操作.實驗人員均經過相應的培訓,熟悉儀器的操作和整個性能評價實驗方案.在性能評價期間,室內質控品檢測結果合格后再進行各項實驗.

1.4 驗證與評價方案

1.4.1 精密度評價

參照美國臨床實驗室標準化研究所協會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)EP5-A2標準[10]選取低值和高值2個濃度的質控品(批號MJ0251),標示濃度分別為(30±5)ng/ml和(160±25)ng/ml,按標本檢測程序先在1 d內連續測定20次,然后每日測定1次,連續20 d,分別計算日內和日間均值、標準差和變異系數.將結果與試劑說明書不精密度數據進行比較,如果日內和日間不精密度均小于廠商數據指標,則精密度驗證通過.

1.4.2 準確度評價

由于目前國內MMP-3尚無公認的有證參考物質,也無室間控制品來評估準確度.因此,參照CLSI EP15-A2標準[11]和畢波等[12]的報道,采用復測不同批號校準品計算偏差的方式進行準確度驗證實驗.即采用批號為815RLM(EXP:2016年10月)的校準品校準檢測系統后,對另一批號為816RBN(EXP:2017年1月)的校準品進行檢測,計算檢測結果與標示值的偏差,并與實驗室規定的允許偏差進行比較,如果偏差小于實驗室的允許偏差,則該項目準確度符合要求.檢測項目的允許偏差可來源于CLIA'88、基于生物學變異的技術規范、專業指南等文件,如果上述文件中都未規定該檢測項目的允許偏差,可基于該項目當前所能達到的技術性能[13].

1.4.3 測量范圍評價

參照CLSI EP6-A2標準[14]在試劑說明書的線性范圍兩端選取低濃度和高濃度兩個標本各1份,命名為低濃度標本(L)和高濃度標本(H),然后將L和H按照5 L、4 L+H、3 L+ 2 H、2 L+3 H、1 L+4 H和5 H配成6個濃度的系列標本.每個標本重復檢測2次,記錄結果并計算線性回歸方程和相關性系數r2,若r2>0.995,則表明線性關系良好,可接受廠商的分析測量范圍.通過用低濃度標本稀釋檢測結果高于分析測量范圍標本的方式,配制成合適濃度的標本用于評價實驗.通常,配制好的高值標本應高于分析測量范圍上限的90%.

1.4.4 檢出能力評價

對于非配套檢測系統,應根據CLSI EP17-A2指南[15]的要求來確立其檢出能力,包括空白檢出限(LoB)、檢出限(LoD)和定量檢出限(LoQ)等相關參數.選擇制造商給出的測量范圍下限10 ng/ml作為其LoQ進行驗證.根據CLSI EP17-A2指南,選擇僅基于不精密度目標的LoQ驗證方式,采用CLSIEP15-A2不精密度驗證指南,選取接近LoQ濃度的2個低值標本,用標記濃度為0的校準品對標本進行稀釋至LoQ附近;對這2個標本進行連續4 d檢測,每日重復測定5次,總計獲得20個有效數據計算不精密度,所有檢測在一個試劑批號內完成,如果有離群數據需刪除后補足.若20個標本檢測數據的不精密度小于制造商指標,LoQ驗證通過.

1.4.5 臨床可報告范圍評價

臨床可報告范圍是指患者標本經稀釋、濃縮或其他處理后,向臨床所能報告的結果范圍.選取高值標本3份,應有1份標本濃度接近分析測量范圍上限1600 ng/ml(至少應高于分析測量范圍上限的90%).將樣本通過建議的5倍稀釋倍數通過儀器自動以生理鹽水稀釋后檢測2次取均值,將均值乘以稀釋倍數來計算回收率,回收率為90%~110%,則驗證稀釋可靠,可以將線性范圍上限乘以稀釋倍數直接作為該項目的臨床可報告范圍的上限.

1.4.6 生物參考區間驗證評價

參照國家行業標準《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》(WS/T402-2012)[16]分別選擇成年表觀健康體檢者男性、女性各65名,除了風濕、類風濕性關節炎、骨質疏松、肝腎功能、血糖、血脂、血常規、血沉及C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)等檢測指標以外均正常;相對較大樣本數量來對試劑盒說明書中的生物參考區間進行驗證,驗證結果應該具有較大的參考價值.若≤5%的結果超出聲明的參考區間,則驗證通過,可以采用說明書中的生物參考區間.

1.4.7 分析干擾能力評價

(1)分析干擾能力.分析干擾是影響檢測方法準確性的關鍵因素,要準確識別和評價臨床檢測中各種干擾因素對測定結果的影響相當困難,一般對于配套檢測系統,可以直接引用制造商的抗干擾能力聲明,但對于非配套檢測系統,應對常見的干擾因素如膽紅素、血紅蛋白及乳糜顆粒對測定結果的干擾進行初步評價.本實驗室依據CLSI EP7-A2指南[17]的建議,采用添加外源性干擾物的方式來進行MMP-3抗干擾性能的評估,購買日本Sysmex公司A PLUS系列干擾物,標示濃度分別是膽紅素F 20 mg/dl(游離型),膽紅素C 20 mg/dl(結合型),溶血血紅蛋白50 mg/dl,乳糜2000 FTU(福爾馬肼濁度)的干擾物和對應的空白液.將溶解好的干擾物和空白液分別與相同的標本按比例混合,制成不同稀釋比例的標本進行檢測,判斷其受干擾的程度.

(2)操作方法.①將試劑盒中的干擾物和對照空白液分別按要求用純化水溶解好備用;②將溶解好的干擾物1.0 ml與9.0 ml基礎標本混合制成標本A,將溶解后的空白液1.0 ml與同樣的9.0 ml基礎標本混合制成標本B,標本A為干擾標本,標本B為對照標本;③將標本A和標本B配制成不同稀釋比例的標本,其中標本A:標本B=0:1的標本為對照標本,其他為干擾標本,重復檢測2次取均值,并計算干擾標本和對照標本間的偏差,以此偏差作為干擾值;④以干擾值≤±10%作為是否存在明顯干擾的判定標準;⑤干擾值(%)=(干擾標本測定值-對照標本測定值)÷對照標本測定值X100%.配制不同稀釋比例的干擾標本見表1.

表1 不同稀釋比例干擾標本配置

1.5 統計學方法

所有數據處理均采用Microsoft office EXCEL 2007完成.

2 結果

2.1 不精密度評價實驗

低值和高值2個濃度水平的MMP-3質控品日內不精密度分別是4.6%和1.2%,日間不精密度分別是5.8%和2.3%,均低于廠商的不精密度指標,見表2.

表2 不精密度評價實驗結果

2.2 準確度評價實驗

廠商說明書的準確度性能指標為±20%,采用廠商聲明的1/2作為實驗室允許偏差.采用批號為815RLM的校準品校準檢測系統后,對另一批號為816RBN的校準品進行檢測,重復檢測3次計算均值.對應的5個不同濃度校準品檢測結果均值與標示值的偏差為0.2%~2.3%,均低于實驗室規定的允許偏差,見表3.

2.3 測量范圍分析評價

以配制好的標本的實測均值為Y,預期值為X,計算線性回歸方程Y=bX+a.根據實驗數據可以得出線性回歸方程為Y=1.03X+5.7,r2=0.9921.相關性系數r2>0.975,直線回歸方程b為0.97~1.03,數據組呈線性關系.驗證的MMP-3分析測量范圍為10.65~1498.05 ng/ml,與試劑說明書指標的10~1600 ng/ml接近,可以接受制造商聲明的分析測量范圍,見表4.

表3 準確度評價實驗結果

表4 測量范圍數據分析(ng/ml)

2.4 檢出能力評價

試劑說明書聲明不精密度目標為10%,聲明的測量范圍下限為10 ng/ml.對2個濃度在10 ng/ml附近的標本進行連續4 d檢測,每日重復5次,計算其不精密度均小于說明書指標的10%,LoQ驗證通過,檢出能力驗證數據見表5.

表5 檢出能力驗證數據(ng/ml)

2.5 臨床可報告范圍評價

將3份高值標本以儀器5倍自動稀釋檢測2次后取均值,結果與原始濃度對比,計算回收率,以回收率為90%~110%之間判定為合格.檢測3份標本的稀釋回收率均合格,臨床可報告范圍為10~8000 ng/ml,見表6.

表6 臨床可報告范圍評價結果

2.6 生物參考區間評價

MMP-3試劑說明書聲明的生物參考區間為男性36.9~121.1 ng/ml,女性17.3~59.7 ng/ml,在表觀健康體檢者檢測結果中,僅女性組有2名超出說明書指標的范圍,占所有女性組65名體檢者的3.1%,而男性組65名結果全部在說明書的范圍內,驗證合格,可接受廠商指標的生物參考區間.

2.7 分析干擾能力評價

通過添加系列濃度的外源性干擾物對臨床常見的膽紅素F、膽紅素C、血紅蛋白和乳糜4種干擾物對MMP-3檢測試劑盒的干擾性能評價,以干擾值<10%作為評價標準,實驗結果在游離膽紅素濃度<20 mg/dl、結合膽紅素濃度<20 mg/dl、血紅蛋白<500 mg/dl以及乳糜<2000 FTU時對檢測結果的影響較小,干擾值均低于10%,見表7~10.

表7 干擾物膽紅素F干擾試驗結果

表8 干擾物膽紅素C干擾試驗結果

表9 干擾物溶血血紅蛋白干擾試驗結果

表10 干擾物乳糜干擾試驗結果

3 討論

隨著我國衛生事業的發展,國內檢驗醫學在近20年來取得了長足的進步.當前國際主流的檢測設備、體外診斷試劑盒等基本是同步應用于許多國內大中型醫院實驗室,與此形成鮮明對比的是在實驗室質量管理上與國外先進實驗室仍存在不小的差距.在美國,《臨床實驗室改進法規修正案》(CLIA'88)[18]的頒布和不斷修訂,對實驗室的檢測質量起到了很好的管理和指導作用,其明確規定了在應用于患者常規報告結果之前,實驗室要對檢測系統的主要分析性能如不精密度、準確度、分析測量范圍/臨床可報告范圍等進行評價.2006年原國家衛生部頒布《醫療機構臨床實驗室管理辦法》,作出同樣規定以保證國內實驗室的檢測質量.近10年來,隨著ISO15189實驗室認可在國內日益受重視,廣大實驗室工作人員也對方法學性能評價有了更多的關注和認識.檢測系統的分析性能滿足當前臨床要求是開展實驗室質量管理工作的根本保障,因此在選擇和應用新的檢測方法之前,應按要求對其進行方法學性能評價,以確認是否能滿足臨床檢測的要求.

本研究依據當前系列行業指南[10-11,14-17]和文獻報道,對MMP-3檢測系統的不精密度、準確度、分析測量范圍、檢出能力、臨床可報告范圍、生物參考區間以及對膽紅素、溶血血紅蛋白、乳糜顆粒等常見干擾物抗干擾能力進行了初步的評價.實驗結果表明,本檢測系統日內和日間不精密度均小于試劑說明書聲明的10%.準確度評價實驗因為當前MMP-3檢測無公認的參考物質和參考測量程序,也無合適的室間質量評價材料,所以采用類似校準驗證的方式來進行,依據當前技術水平采用說明書聲明的準確度性能的1/2來作為評價標準,偏差在允許范圍內.分析測量范圍、檢出能力的評價結果表明,可以接受廠商指標的10~1600 ng/ml作為本方法的分析測量范圍.同時通過稀釋倍數驗證實驗結果證明可以將高值標本進行5倍稀釋檢測,從而將臨床可報告范圍拓展至10~8000 ng/ml.在表觀健康體檢者中,65名男性結果全部在說明書指標的范圍內,而65名女性中只有2名超出,驗證合格.干擾試驗結果表明,游離膽紅素濃度<20 mg/dl、結合膽紅素濃度20 mg/dl、血紅蛋白<500 mg/dl以及乳糜<2000 FTU時對檢測結果影響輕微.

本研究實驗驗證了MMP-3檢測試劑盒在MODULAR P800型全自動生化分析儀上性能滿足或高于試劑說明書指標,可以應用于臨床.本研究中采用的評價方法,對基層實驗室工作具有一定的參考意義.