甲醛對SH-SY5Y細胞的損傷作用

李紅威，張 玲，李 卓，秦 川

(國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021)

甲醛是一類廣泛存在于自然環境和人類生活環境中的醛類分子，其分子結構簡單，化學性質活潑，是一種能導致DNA損傷的毒性分子，它是一種強力的蛋白質和DNA交聯劑[1-2]。但在體細胞增殖和發揮正常功能所必須的一碳循環(one carbon cycle)中，絲氨酸酶解生成內源性甲醛，內源性甲醛作為體細胞正常生命活動的一種副產物，機體在維持正常生理機能和代謝平衡方面有著固有的抵御甲醛威脅的雙重保護機制，使機體免受內源性甲醛的侵害。機制之一即醇脫氫酶3(ADH3)將內源性甲醛轉化為甲酸[3]，進而促進核苷酸的合成；而通過范科尼貧血途徑(Fanconi anaemia pathway)進行DNA交聯修復，逆轉甲醛所致的DNA損傷為機制之二[4]。

過量的甲醛會對機體產生危害，有研究發現[5]在甲醛濃度超標的環境中長期工作，對暴露者的記憶力、注意力以及感覺認知等方面均有不同程度的損害。臨床研究表明[6]，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者的尿液甲醛濃度顯著高于同齡正常老年人，且與認知功能下降程度呈正相關。神經細胞特別是神經元的減少和丟失是認知障礙性疾病AD的特征性病理表型[7]。然而，目前對甲醛損傷神經細胞的機制尚未完全闡明。因此，本研究，我們利用SH-SY5Y細胞系作為神經細胞的體外模型，探索甲醛對神經細胞的損傷作用，為甲醛損傷神經細胞的機制提供一定的科學依據，也為我們后續建立神經細胞損傷的體內模型提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究選用人源神經母細胞瘤細胞(SH-SYSY)細胞系作為研究對象，由北京協和醫學院細胞資源中心/國家實驗細胞資源共享平臺提供。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(FBS)、RPMI-1640購自美國Gibco公司；甲醛、PMSF購自美國Sigma公司；Cell Titer-Glo? Luminescent Cell Viability試劑盒購自美國Promega公司；NE-PER Nuclear and Cytoplastic Protein Extraction試劑盒、Protease inhibitor cocktail購自美國Thermo公司；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒購自日本同仁公司；T231兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；6E10鼠單克隆抗體購自美國Biolegend公司；DRP1(dynamin-related protein 1)兔單克隆抗體購自美國CST公司；MID49(mitochondrial dynamics protein 49)、MID51(mitochondrial dynamics protein 51)兔多克隆抗體購自美國Proteintech公司；anti-β-tubulin內參購自中國中杉金橋公司。CO2恒溫培養箱購自美國NAPCO公司；超凈工作臺購自中國北京半導體設備廠；流式細胞儀購自美國AccuriTMBD Biosciences公司；多功能酶標儀購自美國PerkinElmer公司；JEM-1400 Plus電鏡購自日本電子株式會社；化學發光成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

將SH-SY5Y細胞在完全培養基中進行培養，培養基成分包括：10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素及RPMI-1640，置于培養箱(37℃、5% CO2)中進行培養。選取對數生長期進行實驗。

1.3.2 細胞實驗分組與處理

若無特殊說明，細胞實驗分組均按表1所示進行處理。

表1 細胞實驗的分組及處理

注：處理方式即將不同濃度甲醛加入RPMI-1640完全培養基/無血清培養基中混勻而成。

Note. The treatment method involved mixing of different formaldehyde concentrations into RPMI-1640 complete or serum-free medium.

1.3.3 細胞劃痕實驗

實驗具體步驟參照文獻[8]進行，處理完畢立刻于顯微鏡下選取固定位點，拍照后放入培養箱中繼續培養。之后分別以6 h、12 h、24 h為時間點拍照，最后用Image-pro Plus軟件計算細胞劃痕面積變化；處理30 h后高倍觀察并拍照。

1.3.4 細胞活性檢測實驗

將細胞以104個/mL的比例接種于管壁不透明的96孔板內，每孔100 μL細胞懸液，每個處理組設置5個復孔，同時設置空白對照孔，只加入培養基而不加入細胞；第二日將常規培養基更換為含甲醛的培養基，分別作用2 h和4 h時，提前30 min從培養箱取出平衡至室溫，加入100 μL/孔CellTiter-Glo試劑，室溫孵育10 min后在酶標儀檢測化學發光值。

1.3.5 細胞凋亡檢測

參照文獻[9]應用Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒進行各處理組的細胞凋亡檢測，其中Annexin V-/PI-代表細胞正常；Annexin V+/PI-代表細胞早期凋亡；Annexin V+/PI+代表細胞晚期凋亡/死亡；Annexin V-/PI+代表細胞機械性死亡。

1.3.6 透射電鏡檢測細胞超微結構

將各組細胞處理完畢后用0.125%胰酶消化，離心后棄上清，PBS重懸，使其密度不低于1×107個/mL，再離心形成細胞沉淀，加入足量2.5%戊二醛，4℃固定過夜。第二日用PBS(pH=7.2)沖洗三次，每次10 min；之后1%鋨酸4°C固定2 h，雙蒸水沖洗三次，每次10 min；梯度乙醇脫水，環氧丙烷置換處理，樹脂浸透，包埋，制成90 nm厚的超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，應用JEM-1400 Plus電鏡觀察。

1.3.7 免疫印跡檢測相關蛋白表達

細胞以相同濃度接種于6孔板，待生長至對數生長期時，加入各處理因素，作用4 h。處理結束后收集細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解細胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，濃縮膠為5%，分離膠為10%，加樣量為30 μg，60 V恒壓電泳30 min至條帶到達分離膠(溴酚藍到達分離膠)，調至100 V恒壓電泳至蛋白marker分離開合適間距(約1～1.5 h)，即結束電泳。用濕法電轉印將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上(300 mA，1 h)，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫孵育60 min，分別加入一抗T231、6E10、DRP1、MID49、MID51，稀釋比例均為1∶1000，4℃過夜；第二日TBST漂洗三次，每次10 min，然后加入二抗，稀釋比例1∶7500，室溫孵育1 h；anti-β-tubulin內參(1∶7500)室溫孵育1 h；TBST漂洗三次，將ECL發光試劑A和B液等體積混合，均勻加到PVDF膜上，反應約1 min，置于化學發光成像系統中，自動顯影。利用Image J軟件進行條帶光密度值的分析，并利用目的蛋白與內參蛋白條帶的光密度比值比較目的蛋白的相對表達量，從而比較不同樣本目的蛋白的相對表達量之間的差異。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 甲醛對SH-SY5Y細胞遷移能力的影響

相對于對照組，甲醛處理組的SH-SY5Y細胞的遷移能力降低，其與甲醛濃度相關。甲醛處理濃度越高，對遷移能力的影響越大，細胞遷移能力越低。如圖1所示，在甲醛作用24 h后，與對照組相比，甲醛組劃痕縮小面積均存在顯著性差異(P<0.001)。FA-1(1 mmol/L)組細胞則在甲醛作用19 h后全部死亡，而在培養24 h后FA-0.5(0.5 mmol/L)組細胞死亡約10%，FA-0.25(0.25 mmol/L)組也存在少量細胞死亡現象。

注：A：劃痕后于0 h、6 h、12 h、24 h拍照圖片；B：劃痕24 h后各組間遷移面積的比較；C：劃痕后0 h、6 h、12 h、24 h各組遷移面積的改變。與對照組比較，***P<0.001。標尺=100 μm。圖1 劃痕實驗顯示甲醛作用對SH-SY5Y細胞遷移能力的影響Note. A, Images acquired at 0 h, 6 h, 12 h, and 24 h after scratching. B, Comparison of migration areas between groups at 24 h after scratching. C, Changes in migration area of each group at 0 h, 6 h, 12 h, and 24 h after scratching. Compared with the control group, ***P<0.001. Bars=100 μm.Figure 1 Scratch testing revealed the effect of formaldehyde on the migratory ability of SH-SY5Y cells

2.2 甲醛對SH-SY5Y細胞活性的影響

結果如圖2所示，與對照組相比，在甲醛作用2 h后，FA-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)及FA-0.25(0.25 mmol/L)組細胞存活率均顯著降低，P值分別為0.0003，0.0460， 0.0400；而FA-0.1(0.1 mmol/L)組、FA-0.05(0.05 mmol/L)組細胞存活率雖然有所降低，但差異無統計學意義，P值分別為0.072，0.095。在甲醛作用4 h后，與對照組相比，FA-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)組及FA-0.1(0.1 mmol/L)組細胞存活率均顯著降低，P值分別為0.001，0.002， 0.001，0.002；而FA-0.05(0.05 mmol/L)組細胞存活率雖然有所降低，但差異無統計學意義，P=0.101。在FA-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)組，作用4 h與作用2 h相比，細胞存活率也出現顯著降低(P<0.05)，P值分別為0.014，0.037，0.044；而在FA-0.1(0.1 mmol/L)組和FA-0.05(0.05 mmol/L)組，作用4 h與作用2 h相比，細胞存活率差異不存在統計學意義，P值分別為0.382，0.990。

注：分別于甲醛作用2 h、4 h檢測。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；同一處理濃度組內的不同時間比較，#P<0.05。圖2 CTG細胞活性實驗顯示甲醛對SH-SY5Y細胞活性的影響Note. Detection after formaldehyde treatment for 2 h and 4 h, respectively. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Comparison between different time points within the group treated with the same concentration, #P<0.05.Figure 2 CTG cell viability assay revealed the effect of formaldehyde on SH-SY5Y cells

2.3 甲醛對SH-SY5Y細胞形態的影響

在中高倍顯微鏡下觀察細胞形態改變。如圖3所示，當甲醛作用30 h后拍照，與對照組相比，甲醛處理組細胞隨著甲醛濃度的升高，細胞形態的改變愈加明顯。FA-0.05(0.05 mmol/L)組細胞數量輕度減少，細胞形態與對照組相似，細胞結構清晰；而FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)、FA-0.1(0.1 mmol/L)組細胞依次減少，細胞形態逐漸不規則，神經突樣結構變短、消失，出現大量凋亡及死亡細胞；而FA-1(1 mmol/L)組細胞則全部死亡，只留細胞輪廓尚存，細胞失去活性，暗淡無光。

2.4 甲醛對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

結果如圖4所示，與對照組相比較，FA-1(1 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)、FA-0.25(0.25 mmol/L)、FA-0.1(0.1 mmol/L)組的細胞早期凋亡水平顯著性升高(P<0.001)，而FA-0.05(0.05 mmol/L組細胞的早期凋亡水平與對照組未見顯著性差異，P=0.078；這與細胞活性檢測實驗結果相一致。在晚期凋亡方面，甲醛處理組與對照組相比，細胞凋亡水平均存在顯著性差異(P<0.05)，FA-0.05(0.05 mmol/L)組不同時間比較，P=0.043；其余各組相比，均P<0.001。

注：中高倍顯微鏡下拍攝細胞形態，于甲醛作用30 h后拍攝。藍色標尺=100 μm。圖3 甲醛作用對細胞形態的影響Note. Cell morphology was photographed under medium- and high-magnification 30 h after formaldehyde treatment. Blue bars=100 μm.Figure 3 Effect of formaldehyde on cell morphology

注：A：Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡水平(%)，包括早期凋亡和晚期凋亡及死亡細胞的水平。B：不同處理組間細胞凋亡率相比較，可見與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與不同濃度甲醛處理組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。圖4 甲醛對SH-SY5Y細胞的凋亡的影響Note. A, Annexin V/PI double staining assay for apoptosis levels (%), including early apoptosis, late apoptosis, and dead cells. B, Ratios of apoptotic cells in different treatment groups were compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001; or compared between formaldehyde treatment groups of different concentrations, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001.Figure 4 Effect of formaldehyde on apoptosis in SH-SY5Y cells

2.5 甲醛對SH-SY5Y細胞超微結構線粒體的影響

注：A：不同處理組間亞細胞器線粒體的比較，包括2000倍視野下的平均數量與形態改變，紅色箭頭指示線粒體；B：不同處理組間2000倍視野下線粒體的平均數量比較，與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與不同濃度甲醛處理組比較，##P<0.01。圖5 甲醛對SH-SY5Y細胞線粒體的影響Note. A, Comparison of mitochondria between different treatment groups, including the average number and morphological changes under a 2000× visual field. Red arrows indicate mitochondria. B, Average number of mitochondria in 2000× field of different treatment groups was compared with the control group, *P<0.05, ***P<0.001; or compared between formaldehyde treatment groups of different concentrations, ##P<0.01.Figure 5 Effect of formaldehyde on mitochondria of SH-SY5Y cells

在透射電鏡下觀察SH-SY5Y細胞，對其超微結構線粒體進行重點觀察，發現不同處理組間線粒體的損傷程度存在一定的差異。如圖5所示，在數量方面，對照組細胞線粒體密集，均勻分布；與對照組相比，FA-0.05(0.05 mmol/L)組和FA-0.1(0.1 mmol/L)組線粒體數目雖有所減少，但差異無統計學意義，P值分別為0.158，0.288；FA-0.25(0.25 mmol/L)組則線粒體數目顯著性減少，P=0.013；FA-0.5(0.5 mmol/L)組和FA-1(1 mmol/L)組與對照組相比，線粒體數目減少地更加顯著，P值分別為0.0009，0.0007。而在線粒體形態方面比較，對照組線粒體雙層膜結構清晰，線粒體嵴分布均勻；與對照組相比，FA-0.05(0.05 mmol/L)組與對照組形態近似，體積稍大(膨脹)；FA-0.1(0.1 mmol/L)組線粒體大部分形態正常，偶見雙層膜崩解現象；FA-0.5(0.5 mmol/L)組和FA-1(1 mmol/L)組則線粒體腫脹明顯，部分線粒體殘留少量內嵴或嵴結構完全消失。

2.6 甲醛對SH-SY5Y細胞磷酸化tau蛋白及線粒體裂解相關蛋白表達的影響

利用免疫印跡實驗(western blot)檢測Control、FA-0.25(0.25 mmol/L)、FA-0. 5(0.5 mmol/L)及FA-1(1 mmol/L)組不同處理組間SH-SY5Y細胞蛋白表達水平，包括Aβ(6E10)、磷酸化tau蛋白(T231)，線粒體裂解相關蛋白DRP1、MID51、MID49。結果如圖6A、6B所示，與對照組相比，FA-0.25(0.25 mmol/L)組、FA-0.5(0.5 mmol/L)組和FA-1(1 mmol/L)組T231位點的磷酸化tau蛋白表達量明顯增高，差異存在統計學意義，P值分別為0.016，0.006，0.010。而甲醛處理組之間的表達量無明顯差異，P>0.05。Aβ(6E10)雖然在甲醛處理組表達量略有升高，但差異無統計學意義，與對照組相比，P值分別為0.048，0.076，0.117。DRP1、MID51、MID49為線粒體裂解相關蛋白，當線粒體裂解增強時，其表達增多。如圖6C所示，與對照組相比，三種蛋白表達都有顯著增多(P<0.05)，但DRP1和MID51并未表現出甲醛處理組之間存在差異，而MID49除較對照組明顯表達升高外，FA-0.25(0.25 mmol/L)組與FA-0.5(0.5 mmol/L)組，FA-0.25(0.25 mmol/L)組與FA-1(1 mmol/L)組間表達量均存在顯著差異，P值分別為0.012，0.023。

注：A：T231、6E10、DRP1、MID51、MID49的免疫印跡蛋白表達條帶；B：不同處理組SH-SY5Y細胞中T231、6E10蛋白表達的灰度分析結果；C：不同處理組SH-SY5Y細胞中DRP1、MID51、MID4蛋白表達的灰度分析結果。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；不同濃度甲醛處理組間比較，#P<0.05。圖6 甲醛對SH-SY5Y細胞磷酸化tau蛋白及線粒體裂解相關蛋白表達的影響Note. A, Western blot showing protein expression of T231, 6E10, DRP1, MID51 and MID49. B, Grayscale analysis results of T231 and 6E10 protein expression in SH-SY5Y cells of different formaldehyde treatment groups. C, Grayscale analysis results of DRP1, MID51, and MID4 protein expression in SH-SY5Y cells of different formaldehyde treatment groups. Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01. Comparison between groups treated with different concentrations of formaldehyde, #P<0.05.Figure 6 Effect of formaldehyde on expression of phosphorylated tau proteins and mitochondrial fission-associated proteins in the SH-SY5Y cells

3 討論

甲醛在人體中，血液甲醛濃度的范圍是20～100 μmol/L[4]。而本實驗圍繞正常血液濃度設置甲醛處理組的濃度梯度，對SH-SY5Y神經細胞模型進行處理。發現0.1 mmol/L甲醛作用4 h即可降低細胞生存活性和增殖能力，且甲醛對神經細胞的毒性作用與作用時間和劑量呈正相關。相比于對照組，甲醛濃度越高，對SH-SY5Y細胞的遷移能力的抑制作用越明顯。而作用時間越長，對SH-SY5Y細胞的生長存活能力、增殖能力抑制性越顯著。細胞的遷移能力是正常細胞的基本功能之一，是機體正常生長發育的重要生理過程，遷移也是活細胞普遍具備的一種運動形式[10]。機體在炎癥反應、免疫反應以及血管生成、傷口愈合等過程中都會涉及細胞遷移。而甲醛對細胞的遷移能力的抑制，無疑是對其正常生理功能的干擾和損傷。而本研究中細胞活性實驗檢測的結果表明，甲醛作用濃度越大，對細胞的存活能力損傷越顯著，其結果就是導致神經細胞的凋亡和壞死[11]。這可能是由于甲醛導致蛋白質和DNA的交聯作用，引起DNA大量損傷，而超出了細胞自身修復的能力，最后導致神經元的死亡和減少。

在神經病理學方面，認知障礙腦病理的重要表型是神經元的變性和凋亡[12-13]。在本研究中，應用流式細胞儀檢測了不同處理組間SH-SY5Y細胞的凋亡情況，發現甲醛可以誘導SH-SY5Y細胞的凋亡，且與甲醛作用劑量呈正相關。而線粒體是作為一種細胞器，在真核細胞中具有重要的生理功能，是動物細胞內ATP產生的主要場所[14]。在細胞凋亡的線粒體途徑中，由于DNA損傷等因素，會激活Bcl-2家族促凋亡因子，進而導致線粒體通透性增加，線粒體釋放凋亡相關因子，導致蛋白水解酶Caspase-3的激活，最后導致細胞凋亡[13]。研究顯示線粒體內膜通透性的轉變可以導致細胞出現凋亡[15]。這與我們在透射電鏡下觀察到的線粒體形態改變結果相一致。線粒體在較高濃度甲醛作用下，結構受到破壞且數量顯著減少，線粒體雙層膜結構受損，出現腫脹和內部嵴結構消失，是甲醛作用使線粒體膜的通透性改變，從而加劇了細胞的凋亡。

另外，線粒體能夠發生高度的動態變化，能在細胞中發生移位，同時也通過自身的不斷分裂和融合活動而發生形態結構變化。它的分裂與融合動態平衡對機體健康非常重要[16-17]。DRP1(dynamin-related protein 1)蛋白，即線粒體動力相關蛋白，它的主要功能是調控線粒體分裂，它對線粒體分裂活動以及維持線粒體在軸突、樹突和神經突觸的分布都是必不可少的。MID49(mitochondrial dynamics protein 49)和MID51(mitochondrial dynamics protein 51)是線粒體動態蛋白，在線粒體分裂過程中也發揮著重要作用。當線粒體處于分裂期時，MID49、MID51及其他線粒體分裂因子(如Mff)會招募胞漿中的DRP1，并與之結合起來調控線粒體分裂過程。正常表達的DRP1能維持線粒體動力學平衡，維持細胞正常功能。而異常表達的DRP1會引起線粒體動態異常，影響線粒體形態進而導致神經細胞的死亡。有研究顯示[18]，在基因修飾大鼠模型中，過氧化物酶體呈細管狀，認為原因之一是DRP1的表達上調，原因之二是DRP1與Pex11β結合，從而影響了過氧化物酶的功能。我們的研究發現，甲醛作用組DRP1和MID49/51均表達上調，證明線粒體分裂增加，而影響了正常的線粒體功能和分布，導致神經細胞功能受損。這與我們的超微結構觀察結果一致，甲醛作用組線粒體形態異常，數量顯著減少，提示線粒體形態和分布異常，失去正常功能，最終影響神經細胞的功能和活性。

微管系統是神經細胞的骨架成分，tau蛋白是一種微管相關蛋白，它在正常腦中與微管結合，維持微管的穩定性[19-20]。在本研究的免疫印跡檢測中，發現較高劑量甲醛組比對照組的磷酸化tau蛋白含量有顯著增多，這與文獻報道結果一致。有研究將純化的tau蛋白與5%濃度的甲醛溫育24 h后，發現tau蛋白明顯集聚,形成配對螺旋樣二聚體，tau蛋白錯誤折疊成類球形，類似阿爾茨海默病患者腦內的異常超微結構神經原纖維纏結，且其聚集產物有明顯的細胞毒性，可以導致細胞的代謝障礙和死亡。因此提出“內源性甲醛慢性損傷”假說[21]。Aβ陽性斑塊形成增多是神經細胞受損時神經病理的另一個重要特征，但在本研究中，甲醛作用組與對照組相比，Aβ(6E10)蛋白表達量雖有所升高，但未存在統計學意義，這需要我們進一步改進實驗方案進行研究。

綜上所述，甲醛通過抑制細胞遷移、降低生存活性、促進凋亡、破壞線粒體結構和功能并使其分裂增強等途徑損傷神經細胞，同時上調神經細胞tau蛋白的磷酸化水平。