實驗小鼠、大鼠微衛星DNA檢測法標準的編制

王 洪，魏 杰，馮育芳，付 瑞，王淑菁，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

實驗動物遺傳質量是決定科研數據可重復性的關鍵因素，我國目前急需在該領域建立分子生物學方法，實現對實驗動物遺傳質量的有效控制。結合實際工作需求，中國實驗動物學會提出了小鼠、大鼠微衛星DNA標記檢測方法團體標準的研究和建立，由中國食品藥品檢定研究院、首都醫科大學和浙江省醫學科學院共同完成。本文重點介紹了該標準編制的背景和標準內容，旨在強化該團體標準的宣傳和實施，促進我國實驗動物遺傳質量標準化建設，為實驗動物遺傳質量國家標準的修訂提供依據。

1 編制背景

實驗動物遺傳質量控制是實驗動物質量控制中的關鍵環節。生物醫學研究中必須使用遺傳背景明確，符合其品系遺傳特征的實驗動物，才能獲得可信的，可重復的科研數據。在我國，實驗動物的遺傳質量控制主要應用國家標準GB/T 14927.1-2008中推薦的生化標記檢測法，該方法自上世紀90年代投入使用，一直沿用至今，該方法在實驗動物遺傳質量控制方面發揮著至關重要的作用。在國際上，越來越多的實驗室應用微衛星標記，SNP標記等DNA標記方法進行實驗動物的遺傳質量檢測。在美國，Jackson Lab 采用SNP方法(28個位點)作為實驗動物的遺傳質量控制手段[1]。我國國家標準GB 14923-2010 哺乳類實驗 動物的遺傳質量控制中也對封閉群實驗動物的遺傳質量監測提出明確規定，并推薦使用DNA標記方法。

目前，我國實驗動物遺傳質量控制方面急需解決的問題主要是：①現行的生化標記檢測法存在一定的局限性：位點數量少，位點多態性低，位點未能實現全基因組覆蓋，完成檢測需要處死實驗動物；②DNA標記方法在我國實驗動物遺傳質量控制方面的應用尚屬空白；③缺少DNA檢測方法的標準。

微衛星DNA是動物基因組中的簡單重復序列，該重復序列比小衛星DNA短，所以叫作微衛星DNA(microsatellite DNA)。微衛星DNA的核心序列是以二個核苷酸為重復單位，AC和TG最為多見，核心序列的重復次數是可變的，一般為10 ～ 20次左右，這就是微衛星DNA多態性的基礎。不同個體因為核心序列重復次數的差異，而形成各自特有的遺傳結構。微衛星DNA兩端的側翼序列是相對保守的單拷貝序列，可以根據兩側的特異序列合成引物。微衛星DNA標記可以應用于實驗小鼠和實驗大鼠進行遺傳質量監測，同時開展遺傳組成分析和品系鑒別。在國家標準GB/T 14927.1-2008近交系小鼠、大鼠生化標記檢測法中，是生化標記方法的具體操作內容，目前國內缺乏DNA標記方法相應標準。本標準參考了我國、美國、日本等國家的微衛星DNA標記檢測法[2-7]，本標準的編制可以作為國家標準GB 14927.1-2008的補充。

2 內容編制

2.1 微衛星位點的選擇

微衛星方法和SNP方法均可用于實驗小鼠和實驗大鼠的遺傳質量評價的常用的DNA標記方法。SNP方法檢測實驗動物單核苷酸的差異，能夠提供的動物的遺傳背景信息不如微衛星方法豐富。微衛星方法的優點是：數量多，在基因組中均勻分布；具有豐富的多態性；操作簡便，重復性好[8]。本標準中的微衛星位點的選擇參考國內外相關文獻，切合我國國內實際現狀，并可持續完善。標準中選用的微衛星位點經過嚴格的篩選和優化。優化原則包括：①選擇多態性豐富的位點，摒棄在多個品系間無多態性的位點；②選擇覆蓋實驗小鼠和實驗大鼠的全部染色體的微衛星位點，力求全面客觀體現動物品系的遺傳背景；③選擇電泳條帶清晰，界限明確，雜帶少的位點，減少非特異性擴增對檢測結果的影響。該標準中的微衛星檢測法經過廣東、浙江和北京的三家實驗室對其重復性進行驗證，結果表明三家實驗室獲得完全一致的檢測結果，證明該方法具備可行性和良好的重復性。通過參加國際實驗動物科學理事會(International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS)開展的遺傳標準品項目(Genetic Reference Program)，應用12個品系近交系小鼠的DNA標準品完成對微衛星檢測法的適用性研究。結果表明，該標準方法是國際通用的實驗動物遺傳質量評價方法。標準中采用30個小鼠微衛星位點用于近交系小鼠的遺傳質量檢測和封閉群小鼠的群體遺傳結構分析，具體位點信息見表1。標準中采用6個大鼠的微衛星位點用于近交系大鼠的遺傳質量檢測，采用25個大鼠的微衛星位點用于封閉群大鼠的群體遺傳結構分析，具體位點信息見表2和表3。

2.2 近交系小鼠和近交系大鼠遺傳質量評價

近交系實驗動物是指經過20代以上連續全同胞或親子交配，近交系數達到98.6%以上的動物群體。近交系動物同一品系中不同個體的遺傳背景完全相同，所有遺傳標記都是純合的。近交系小鼠的品系數量多，每一個品系擁有自身特有的遺傳背景。當進行近交系小鼠的遺傳質量檢測時，應根據檢測目的選取微衛星位點，如果僅用于區別少數近交系小鼠，可選擇10個微衛星位點；如果待檢測近交系品系數量多，可選擇20個微衛星位點。原則上需選取覆蓋小鼠20條染色體的20個微衛星位點。參見表4所示7個近交系小鼠品系的遺傳背景。

近交系大鼠的品系數量較少，用表2中的6個微衛星標記，可以區分常見的3個品系的近交系大鼠。

結果判定：近交系小鼠和近交系大鼠同一品系的所有個體在所有微衛星位點均應表現為純合，該品系即為遺傳質量合格的實驗動物。如果同一品系內出現雜合位點，該品系即為遺傳質量不合格的實驗動物。

表1 實驗小鼠30個微衛星位點的擴增條件和染色體分布

表2 近交系大鼠6個微衛星引物序列及常見品系帶型

注：按泳動快慢將條帶按a、b、c依次命名，泳動最快的條帶命名為“a”。

Note. The name of the bands (a, b, c) indicates the band migration speed; the fastest band is named ‘a’.

表3 封閉群大鼠25個微衛星位點序列和染色體分布

(續表3)

位點Locus引物序列(5’→3’)Primer sequences染色體ChromosomeLCATACAGAGCAAGCTCCAGGACTGTTTCTAATCCATAGGAAGTGC13ALBTTTTCGTAGTAACGGAAGCCTAAGGATTCTCAGATGCAAATG14D15Mit3GACCTGACCTGTTGTGGGATGTTGCTCTCTGGCCTCCTC15MBPAACCTACACGGACACATGGTGGTTGTACTTCCTGATTTCCCTTT16ACRMAGGAAATTAAGAGAAGTTGGGACTTATGCTCTTTGGGCAGCTTA17TILPAATCACTGGATGCTGGAAGAAGGGAGCAGAACTACTAAAGATACA18AGTTATGTAACTCAACGCCAGCCTAAGGATTCTCAGATGCAAATG19TNFAGGAAATGGGTTTCAGTTCCCAGGATTCTGTGGCAATCTG20PRPS2GTTTTCCCGCTTCACCAGAGAAGGAGAAAGCGACCGX

表4 常見近交系小鼠在30個微衛星位點的片段大小

2.3 封閉群小鼠和封閉群大鼠群體遺傳質量評價

不同類型的實驗動物有獨特的遺傳檢測需求。必須選擇適當的遺傳質量檢測方式。與近交系實驗動物不同，封閉群實驗動物同一品系不同個體具有多樣化的基因型，所有遺傳標記都是雜合的。對于近交系動物，可以對一個個體進行遺傳質量檢測；對于封閉群動物，至少應采用25只動物進行檢測，才能獲得相對準確的檢測結果。而微衛星位點的選擇，封閉群小鼠在表1中選擇25個微衛星位點，原則上需覆蓋小鼠的20條染色體。封閉群大鼠選取表3中25個微衛星位點進行擴增，原則上需覆蓋大鼠的21條染色體。通過提取DNA，PCR反應，電泳和測序獲取檢測數據，應用軟件POPGEN 1.32和PIC_CALC 0.6對數據進行分析處理。獲取能夠體現封閉群群體遺傳多樣性特征的指標。

封閉群實驗動物群體的遺傳結構，通過群體的平均雜合度，群體的多態信息含量和哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)平衡來體現。如果群體的平均雜合度在0.5～0.7時，群體為合格的封閉群群體；如果群體的平均雜合度小于0.5時，認為該群體趨于近交；如果群體的平均雜合度在大于0.7時，認為該群體趨于野生。遺傳多樣性分析采用國際上通用的多態性信息量(polymorphism information content，PIC)。PIC是指一個標記依靠其可檢測的等位基因數和它們的分布頻率，從而得到該標記在一個群體中檢測的多態性大小值[9]。PIC值的大小在0 ～ 1之間，0表示無多態性，1表示具有非常高的多態性。PIC > 0.5為高度多態性；0.25 < PIC < 0.5為中度多態性；PIC < 0.25為低度多態性[10]。亦可以利用哈代-溫伯格(Hardy-Weinberg)定律判斷封閉群實驗動物群體的遺傳質量合格與否。群體內一個位點上的基因型頻率和基因頻率保持不變，處于遺傳平衡狀態，這一平衡狀態就稱之為Hardy-Weinberg平衡。經過軟件分析可以獲知群體在微衛星位點是否處于Hardy-Weinberg平衡。平衡即判定為遺傳質量合格，不平衡即判定為遺傳質量不合格。

3 應用前景

近交系動物微衛星位點的選取不一定拘泥于20個微衛星位點，可根據需要靈活調整。如果僅用于區分兩個品系的近交系小鼠，選取10個微衛星位點即可滿足需求。初次應用微衛星方法獲得的近交系小鼠的遺傳數據可以作為該品系后續遺傳質量檢測的依據。封閉群的動物進行群體遺傳結構分析時，應采用基礎群實驗動物，動物的數量不應小于25只。動物數量少和非基礎群的動物獲得的數據將對分析結果帶來偏差。

生物醫學的發展離不開實驗動物，實驗動物的發展離不開質量控制。實驗動物的遺傳質量是所有質量控制的基礎。團體標準T/CALAS 21-2017小鼠、大鼠微衛星DNA標記檢測方法的建立彌補了現行國家標準中生化標記檢測法的局限性，微衛星方法的位點數量多且多態性豐富，位點實現了全基因組覆蓋[11]。微衛星方法最突出的優點是，僅需要提取少量血液樣本的DNA即可實現實驗動物的遺傳質量檢測，無需安樂死實驗動物，符合動物福利和3R原則[11]。標準的制定表明我國的實驗動物遺傳質量控制手段邁上了一個新臺階，并且逐步與國際水平接軌，有利于我國實驗動物質量整體水平的提升。