雙氫青蒿素聯合順鉑活化Caspase-6、Lamin A/C表達誘導H1299細胞凋亡

田祺 高立明 尹小波 徐淑鳳 趙靖 劉菲菲 羅坤 石珊珊

秦皇島市第一醫院呼吸一科066000

肺癌的發病率在全世界范圍都在逐漸升高,它也是全世界癌癥相關死亡的主要原因[1-2]。近年來針對肺腺癌的治療手段日益增多,但迄今為止,含鉑化療仍是肺腺癌患者最重要的治療手段之一。因此,尋找能提高化療有效率的新藥物是很值得期待及研究的。

雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是一種青蒿素的衍生物,已被證明具有強力的抗癌活性,能誘導細胞凋亡且無明顯不良反應,因此應用于臨床已有多年[3-4]。近年研究表明,青蒿素、青蒿琥酯和DHA 在一些化療出現多重耐藥的腫瘤細胞株中均已經展現出強力的抗癌活性[5]。據報道,DHA 能增強人類卵巢癌細胞對卡鉑的敏感性[3]。DHA 通過含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)相關的凋亡通路,能夠增強白蘚堿誘導侵襲性肺腺癌A549 細胞的凋亡[6]。DHA 對胰腺癌、白血病、骨肉瘤及肺癌細胞均展現出顯著的抗癌活性[7]。本研究旨在探討DHA 聯合順鉑(cisplatinum,Cis)對H1299 肺腺癌細胞增殖的影響及Caspase家族相關下游凋亡蛋白Caspase-6、Lamin A/C的表達情況。

1 材料及方法

1.1材料 人肺腺癌H1299細胞由解放軍總醫院王平老師惠贈。細胞在含10%胎牛血清及青鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養,細胞培養箱的條件是5%CO2、37℃。

1.2藥品與試劑 DHA 購自重慶華立藥業股份有限公司,溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配成濃度為100 mmol/L 的存儲液;Cis購自齊魯藥業有限公司。青鏈霉素、DMSO、赫斯特(Hoechst)33258、Annexin-V 和碘化丙啶購自美國Sigma公司。RPMI 1640培養基及胎牛血清購自美國Gibco 公司。Caspase-6、Lamin A/C一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國CST公司。

1.3試驗方法及指標 本研究將人肺腺癌H1299細胞按處理藥物不同分為4組,分別為：雙氫青蒿素組;順鉑組;雙氫青蒿素+順鉑組;對照組。

1.3.1腫瘤細胞抑制率 采用MTT 試驗評價DHA 與Cis單用及聯用對H1299 細胞增殖的影響。將H1299細胞稀釋成密度為3×104個細胞/ml的細胞懸液,按每孔100μl鋪96 孔板并孵育過夜。將倍比稀釋的DHA 及Cis分別或聯合加入培養基(DHA 的濃度分別為：2.5、5、10、20、40和80 μmol/L;Cis的濃度分別為1.56、3.12、6.25、12.5、25 和50μmol/L)。將96 孔板置于二氧化碳孵箱中分別孵育24 h 和48 h 后加入MTT 工作液(5 g/L)20μl,繼續培養4 h,棄去上清,加入DMSO 震蕩溶解甲瓚結晶。用酶標儀在490 nm 波長下檢測吸光度(optical density,OD)值,計算藥物處理后對細胞生長的抑制率=1-(實驗組OD 值/對照組OD 值)×100%,使用Calcusyn軟件來計算藥物的半數抑制濃度(50%inhibition concentration,IC50)并評價聯合用藥的抗增殖作用。

本研究采用中效原理(Chou-Talalay聯合指數法)觀察聯合指數的評價[8]。聯合指數的計算方程式為：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+[(Dx)1/(Dx)2]/[(D)1+(D)2]。分子的(D)1、(D)2分別代表聯合抑制x%時藥物1和藥物2的濃度。分母的(Dx)1、(Dx)2分別代表單藥抑制x%時藥物1和藥物2的濃度。CI值＜1、=1 和＞1分別代表協同作用、累加作用和拮抗作用。2種藥物聯合應用抗惡性腫瘤細胞的CI值計算通過Calcusyn軟件完成。

1.3.233258 染色 根據Hoechst 33258 試劑說明對各組細胞核進行染色,染色結束后用倒置熒光顯微鏡觀察及拍照。

1.3.3流式細胞術 將H1299細胞按3×105/孔,鋪6孔板孵育過夜,按不同組別加入處理藥物孵育48 h。收集細胞并用PBS 清洗細胞離心后加入100μl Annexin V結合緩沖液、5 μl Annexin VFITC和10μl碘化丙啶。孵育細胞15 min后再次加入結合緩沖液400μl并吹散細胞,最后用流式細胞儀分析染色后的細胞分布情況。

1.3.4蛋白質印跡法(Western blot) 采用Western blot分析從不同處理組的細胞中提取的凋亡相關蛋白的表達。按不同分組分別處理細胞48 h后收集細胞,PBS清洗離心后在冰上加入RIPA 裂解液震蕩裂解30 min。離心并吸取含總蛋白的上清,煮沸變性后加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液備用。采用BCA 試劑盒進行蛋白定量,獲得不同樣本上樣劑量。等量待測蛋白及蛋白標記物分別加入各孔中,在10% 濃縮膠中80 V 電壓下電泳20 min,12%分離膠中120 V 電壓下電泳50 min。然后轉移到PVDF 膜上,用5%脫脂奶粉進行封閉。TBST 洗膜后用按說明稀釋后的一抗4℃冰箱孵育過夜,再次用TBST 洗膜后用稀釋完成的二抗室溫下孵育1 h。目標蛋白條帶位置加上發光液后在暗室中使用膠片曝光、洗片,膠片掃描入電腦進行分析。

1.4統計學分析 采用統計軟件SPSS 22.0進行數據的統計與分析。數據以±s表示。百分比數值采用Kruskal-WallisH非參數檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1DHA 聯合Cis組對H1299細胞的增殖抑制率高于單藥組 將不同濃度的DHA、Cis及DHA+Cis加入H1299培養基中。結果表明聯合用藥組對H1299細胞的增殖抑制率明顯高于單藥組(P＜0.01),單藥組對細胞的抑制率高于對照組(P＜0.01),見圖1。

圖1 MTT 試驗各組細胞抑制率

2.2DHA 聯合Cis產生協同抑制H1299細胞的作用 通過MTT 試驗計算不同濃度DHA(2.5～80μmol/L)、Cis(1.56～50μmol/L)及聯合用藥處理48 h后對H1299細胞增殖的影響,重復3次。通過中效原理使用Calcusyn軟件計算2種藥物的聯合指數(CI值)均小于1.0,表示聯合用藥具有明顯的協同作用(表1)。

表1 DHA 聯合Cis作用于H1299細胞不同濃度配比的聯合指數

2.3DHA 聯合Cis對H1299細胞產生促凋亡作用 對不同處理組的H1299 細胞進行Hoechst 33258染色,通過熒光顯微鏡觀察細胞核的形態變化。DHA 聯合Cis作用于H1299細胞后細胞核呈現出典型的凋亡形態學表現-染色質聚集、核皺縮以及核碎裂。另外,通過流式細胞術分析不同處理組間H1299細胞的凋亡情況(圖2)。在細胞早期凋亡階段,凋亡細胞的磷脂酰絲氨酸外翻并可與染色劑Annexin-V 結合。而在凋亡后期,由于細胞膜完整性的破壞,核染色劑碘化丙啶能穿透細胞膜將細胞核染色。結果顯示凋亡細胞百分率分別為9.09%(對照組)、17.07%(DHA 20μmol/L 處理24 h)、17.29%(Cis 12.5μmol/L處理24 h)、25.09%(DHA 20μmol/L+Cis 12.5μmol/L 處理24 h),見圖3。

圖2 赫斯特33258染色試驗各組細胞核形態 SP ×400 A：對照組;B：雙氫青蒿素20μmol/L 處理24 h;C：雙氫青蒿素20μmol/L+順鉑12.5μmol/L處理24 h

2.4Western blot檢測各處理組Caspase家族凋亡靶蛋白Caspase-6、Lamin A/C 的表達情況 通過目標蛋白條帶可以看出聯合用藥組Caspase-6及Lamin A/C的活性片段的表達均高于單藥組,單藥組高于對照組(圖4)。

3 討論

近些年,傳統中藥提取物在腫瘤治療中的研究日益受到重視[9]。DHA 是一種青蒿素的衍生物,近些年它的抗癌活性正在被全世界廣泛研究。研究表明DHA 可以通過促進腫瘤細胞凋亡,通過Fe2+介導的直接殺傷作用,抑制腫瘤血管生成等機制達到抗腫瘤作用[10]。因此本研究選擇了DHA及Cis作用于人類非小細胞肺癌H1299細胞株單藥及聯合用藥抗腫瘤的效果并對Caspase-6 和Lamin A/C表達進行分析。

圖3 流式細胞術檢測各組凋亡細胞百分比 A：對照組;B：雙氫青蒿素組;C：順鉑組;D：雙氫青蒿素+順鉑組

圖4 蛋白質印跡法檢測各組凋亡相關蛋白表達情況 A：Lamin A/C 的活性片段Cleaved Lamin A/C 的表達;B：Caspase-6的活性片段Cleaved-Caspase-6的表達

據報道,DHA 與許多其他的抗癌藥物聯用都有較好的協同作用[6,11-12],本研究結果顯示：DHA聯合Cis組對H1299細胞的抑制率明顯高于單藥組。另外,本研究通過DHA 與Cis不同濃度配比下作用于H1299細胞48 h后的細胞抑制率,計算了兩藥聯合的CI值,其結果均小于1.0。進一步證明了DHA 聯合Cis抑制人類肺腺癌H1299細胞增殖具有明顯的協同作用。

細胞凋亡是由細胞內死亡程序活化而引發的細胞的主動死亡[13],其形態學表現主要包括染色質的凝聚、邊集以及細胞核皺縮、碎裂等。本研究中Hoechst 33258細胞核染色的結果顯示雙氫青蒿素聯合順鉑可以引起肺腺癌H1299細胞凋亡。

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族的多個成員,參與細胞的增值、遷移及細胞免疫,同時參與調解細胞的凋亡[14]。Caspase-6已經被證實在執行細胞凋亡的過程中有很大的貢獻[15]。Caspase-6平時以無活性的形式存在,當凋亡信號刺激它是,裂解為具有促凋亡活性的Cleaved-Caspase-6,從而使細胞凋亡[16]。

Lamin A/C是維持細胞核形態的關鍵蛋白[17]。并參與DNA的復制和轉錄。當凋亡啟動時,Lamin A/C可作為Caspase-6活化片段的特異性底物被裂解為2 個相對分子質量分別為47 000和37 000的活性片段[18-19]。二者的活性片段能使細胞核功能失調并共同促進細胞凋亡[20]。本研究發現DHA 聯合Cis 組與單藥組相比能顯著提高Caspase-6及Lamin A/C活性片段的表達,具有更強的促凋亡作用,這與早前的研究結果相符。

本研究表明DHA 聯合Cis能誘導人類肺腺癌H1299細胞的凋亡并具有協同作用。DHA 能增強Cis對H1299的抗癌活性,這與之前的報道結果類似[21]。Caspase家族下游凋亡執行蛋白Caspase-6及Lamin A/C 活性片段的高表達,揭示了其與DHA 聯合Cis引起H1299細胞凋亡存在關聯,可能與激活了Caspase家族相關的凋亡通路,引起腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖有關。這為進一步研究DHA 聯合Cis用于人類非小細胞肺癌的治療提供了有用的信息和理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突