非小細胞肺癌患者病理組織中MTH1的表達和臨床意義的研究

張東偉 孔晉亮 藍冰 王豐 楊朝生 孫雪皎 鐘家將

1柳州市人民醫院呼吸與危重癥醫學科545000;2廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科,南寧530021

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因,發病率高且嚴重危及人類的健康[1]。隨著現代分子腫瘤學的進步,各種分子靶向治療取得了長足的進步,但是肺癌的預后仍然很差[2],急需尋找新的預測肺癌預后分子標志物和新的治療靶點。

癌癥的發生是細胞在各種內外刺激下導致原癌基因和抑癌基因平衡失調的過程,其中氧化應激、缺氧和遺傳障礙起重要的作用[3]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生于多種細胞生物學活動中,ROS 通過氧化核苷酸和蛋白質,誘導基因突變和細胞衰老產生氧化應激作用[4]。ROS可氧化d GTP或DNA中的鳥嘌呤堿基而產生8-氧代-鳥嘌呤。在DNA復制時,DNA聚合酶可以在DNA模板中插入8-氧代-dGTP,從而導致A到C或G 到T 的顛換突變導致細胞增殖失控[5]。mut T 同系物1(mut T homolog 1,MTH1)是一種氧化型嘌呤核苷三磷酸酶,可以將8-氧代-dGTP水解成其單磷酸形式,從而阻止DNA聚合酶將8-氧代-d GTP插入基因組[6],對細胞基因組的穩態起到保護作用。

盡管一些研究提示靶向MTH1可抑制由腫瘤細胞系發展而來的腫瘤的增殖[6],但是MTH1在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表達情況和臨床意義尚不清楚。本研究通過免疫組織化學方法檢測NSCLC 患者中MTH1蛋白的表達,及其與患者臨床病理因素和生存率之間的關系。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2013年3月至2017年3月廣西醫科大學第一附屬醫院及柳州市人民醫院接受手術治療的NSCLC 患者197 例。其中,男120例,女77例;年齡(54.8±18.3)歲,年齡范圍為38～83歲。納入標準：年齡＞18歲,病理診斷為NSCLC;術前未接受放化療。排除標準：患者缺乏足夠的腫瘤組織3例;術后診斷為小細胞肺癌2例,術后的隨訪資料不完整1例;術前行輔助化療和放療3例。最終納入研究197例,對全部病理標準依據TNM 標準進行病理分期[7]。

所有調查患者均取得患者知情同意及書面授權,該研究為患者手術切除部位病理學研究,對患者無任何藥物的干預及處理,無關于試驗研究的軀體性和精神性損害,符合《赫爾辛基宣言》的研究原則。

1.2研究方法 患者入院后即刻收集年齡、性別、吸煙史、EGFR 突變等資料。患者手術后收集病理組織,采用免疫組織化學方法檢測MTH1蛋白的表達。根據MTH1染色細胞占總癌細胞比例[18]確定評分：≤19%為1分,＞19%且≤39%為2分,＞39%且≤59%為3分,＞59%且≤79%為4分,＞79%為5分。當＜60%的腫瘤細胞染色時,評定為MTH1高表達,相關患者進入MTH1 高表達組;≥60%的腫瘤細胞染色時,評定為MTH1低表達,相關患者進入MTH1 低表達組。分析MTH1表達與患者臨床特征之間的關系。進一步繪制患者生存率和無瘤生存率的ROC 曲線,并采用Kaplan-Meier生存曲線法分析MTH1表達與患者預后之間的關系,依據Cox比例風險模型分析患者總生存率和無瘤生存率的獨立影響因素。患者手術后即開始隨訪,術后的前3年每隔6 個月行1次胸部CT 和血液腫瘤標志物檢查,以后每年進行1次胸部CT 檢查,對懷疑復發的患者,采用PET 檢查或病理活檢確診。

1.3病理組織MTH1的免疫組織化學 將患者組織塊包埋在石蠟中,然后在切片機中切成所需的厚度(大約5μm)并貼在載玻片上,在含有4%的PFA 中進行切片的固定,通過在封閉緩沖液中在室溫下孵育30 min來阻斷一抗和組織之間的非特異性染色。根據制造商的說明使用針對MTH1蛋白特異性抗體[兔抗人MTH1抗體,美國西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司]進行稀釋后,將切片與MTH1蛋白特異性抗體在2～8℃下孵育過夜,在洗滌緩沖液中洗滌載玻片3次,每次15 min,然后是根據制造商的說明將HRP綴合的抗兔IgG1(抗兔K4003 Dako,日本和光純藥公司)進行稀釋,與切片進行孵育,在洗滌緩沖液中洗滌載玻片3次,每次15 min。使用DAB底(Brown)試劑盒(Boster)對MTH1的染色信號進行顯色,用蘇木精對組織標本進行復染以區分細胞核和細胞質。

1.4統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行分析,計數資料比較采用Pearsonχ2分析;正態分布計量資料以例數(百分比)表示,采用t檢驗;采用Kaplan-Meier生存分析比較MTH1高、低表達組患者的無瘤生存率和總生存率差異;采用Cox單因素和多因素回歸分析分析NSCLC 患者無瘤生存率和總生存率的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1NSCLC 患者的臨床資料和MTH1表達情況

本研究共納入197例NSCLC 患者,其中104例(52.8%)患者的吸煙指數＞20包年;腺癌140例(71.1%),鱗狀細胞癌42例(21.3%),其他類型為15 例(7.6%)。經免疫組織化學染色后,MTH1高表達組111例(56.3%),MTH1低表達組86例(43.7%)。見圖1。

圖1 非小細胞肺癌組織中MTH1高表達和低表達病理圖片 免疫組織化學染色 ×100 A：MTH1高表達;B：MTH1低表達

2.2MTH1 高、低表達組臨床資料比較 MTH1高表達和男性、吸煙指數≥20包年、鱗癌、TNM分期＞Ⅰ期、腫瘤直徑≥3 cm、淋巴結轉移、胸膜浸潤陽性、淋巴管浸潤和血管浸潤相關(P值均＜0.05),見表1。

2.3MTH1高、低表達組總生存率及無瘤生存率比較 Kaplan-Meier 曲線的生存分析顯示,MTH1高表達組的預后顯著性低于MTH1低表達組。MTH1高表達組和MTH1低表達組5年總生存率分別為81.6%和92.3%(χ2=10.003,P=0.001),見圖2;5年無瘤生存率分別為55.0%和83.7%(χ2=10.117,P＜0.001)見圖3。

圖2 MTH1高、低表達組患者的總生存率比較

圖3 MTH1高、低表達組患者的無瘤生存率比較

2.4MTH1高、低表達組在肺腺癌和肺鱗癌中總生存率及無瘤生存率比較 MTH1 高、低表達肺腺癌患者的5年總生存率分別為76.5%和95.4%(χ2=9.727 3,P=0.003 1),無瘤生存率分別為55.3%和85.3%(χ2=10.105 2,P=0.000 7)。見圖4、圖5。MTH1表達對鱗狀細胞癌組織學患者的總生存率或無瘤生存率無顯著影響。

表1 MTH1高表達組與MTH1低表達組患者臨床參數比較

圖4 MTH1高、低表達組在腺癌中的總生存率比較

2.5NSCLC 患者總生存率的單因素和多因素分析 單因素分析顯示TNM 分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、胸膜浸潤、淋巴管浸潤和血管浸潤、MTH1表達是NSCLC 患者總生存率的危險因素。多因素分析提示MTH1 高表達(HR=1.713,95%CI：1.865～4.118,P=0.047)、淋巴結轉移(HR=9.189,95%CI：2.824～39.457,P＜0.001)、胸膜浸潤(HR=2.216,95%CI：1.041～4.809,P=0.038)是NSCLC患者總生存率的獨立危險因素。見表2。

圖5 MTH1高、低表達組在腺癌中的無瘤生存率比較

表2 非小細胞癌患者總生存率的單因素和多因素分析

2.6NSCLC患者無瘤生存率的單因素分析和多因素分析 單因素分析顯示性別、吸煙程度、TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移、胸膜浸潤、淋巴管浸潤和血管浸潤MTH1表達是NSCLC 患者無瘤生存率的危險因素。多因素分析提示MTH1高表達(HR=1.605,95%CI：1.627～3.248,P=0.039)和淋巴結轉移(HR=4.501,95%CI：1.942～11.546,P＜0.001)是NSCLC 患者無瘤生存率的獨立危險因素。見表3。

3 討論

MTH1是一種氧化型嘌呤核苷三磷酸酶,將8-氧代-d GTP水解成其單磷酸形式,通過清除核苷酸庫中的氧化核苷酸來維持體細胞中遺傳信息完整性,防止細胞在復制過程中將8-氧代G 摻入DNA[8]和8-氧代G 在細胞核中過度累積而導致細胞死亡。癌細胞生長環境常被發現具有比正常細胞更高的氧化應激水平,同時MTH1在癌細胞中高表達,表明MTH1有助于癌細胞增殖,這個觀點已被Kennedy等[9]證實。然而,NSCLC中MTH1蛋白升高的臨床意義尚不清楚。

在本研究中發現MTH1蛋白高表達與NSCLC患者的腫瘤惡性潛能(淋巴結轉移和腫瘤分期晚期)有關。這些發現與先前評估腎細胞癌中MTH1 m RNA 表達的臨床報道一致[10]。MTH1如何影響NSCLC的生物學行為的精確機制尚不清楚。推測可能的機制為：(1)MTH1的表達增加了NSCLC患者癌細胞的惡性潛能。在NSCLC 肺癌的癌細胞中,具有高侵襲性的腫瘤細胞可能較多的暴露在ROS刺激下,誘導MTH1高表達,修復DNA,行快速增殖,使得腫瘤細胞更具有向淋巴管、血管浸潤和胸膜浸潤的潛能。(2)癌細胞代謝研究提示,高侵襲性和進行性增殖癌細胞依賴于有氧糖酵解,實現DNA快速復制,分裂成子細胞并傳播到身體其他部位[11]。這些機制表明癌細胞可能通過MTH1表達的增加逃避ROS所致的DNA損傷,從而表現出更高的惡性潛能,進而影響患者預后。

本研究還發現MTH1高表達患者的無瘤生存率和總生存率均低于MTH1低表達的患者。進一步的多因素分析顯示MTH1高表達是患者無瘤生存率和總生存率的獨立的預后因子。本研究顯示重度吸煙(即吸煙指數≥20包年)患者MTH1高表達患者更多,吸煙則是氧化應激的觸發因素,Asami等[12]表明吸煙量顯著性增加肺組織中ROS的水平。結合本研究的發現,提示吸煙患者肺癌的癌細胞惡性潛能更高,該研究結果支持腫瘤細胞增殖可能需要MTH1的表達來對抗ROS所致的細胞DNA損傷有關。因此,MTH1可能是癌細胞氧化應激的標志物,也是肺癌患者生存期較差的指標[13]。

表3 非小細胞癌患者無瘤生存率的單因素和多因素分析

本研究有以下局限性：首先,本研究為單一機構中進行的回顧性研究,尚需要多中心大樣本的研究驗證;其次,免疫組織化學結果的評估標準問題,盡管本研究通過ROC 曲線尋找最佳的免疫組織化學評分的cut-off值,尚需要建立統一的標準來評估MTH1的表達狀態來區分臨床上亞組。腫瘤細胞中MTH1高表達的精確的機制尚需要進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突