屎腸球菌臨床分離株Eravacycline體外活性及四環(huán)素耐藥基因特征分析

魏影　郭妍　柏柳　陳艷麗　黃嶸赫　王德輝　余治健　陳俊文　鐘婉瑩　陳重　李桂秋

【摘要】 目的：分析新型四環(huán)素藥物Eravacycline對我國屎腸球菌藥物敏感性及分子分型特點。方法：收集深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院屎腸球菌共235株。經(jīng)BD phonixtm 100公司全自動藥敏鑒定系統(tǒng)檢測其常規(guī)藥物藥敏，瓊脂稀釋法測定Eravacycline藥物敏感性，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測四環(huán)素抗性基因（tetM、tetL、tetU、tetK、tetS和tetO）。分析Eravacycline藥敏與四環(huán)素耐藥基因之間關(guān)系。結(jié)果：Eravacycline對屎腸球菌的MIC值≤0.5 μg/mL;

四環(huán)素耐藥基因檢測結(jié)果提示屎腸球菌tetM+tetL+tetU為18.30%（43/235），tetM+tetL為27.23%（64/235），所有含有四環(huán)素耐藥基因的屎腸球菌的MIC≤0.5 μg/mL。結(jié)論：Eravacycline對我國屎腸球菌臨床分離株具有較好的敏感性，四環(huán)素耐藥基因?qū)ravacycline無影響。

【關(guān)鍵詞】 屎腸球菌; 四環(huán)素耐藥基因; Eravacycline; 抗感染藥物敏感性

In Vitro Activity of Eravacycline and Characterisitics of Tetracycline Specific Resistance Genes in Enterococcus Faecium Clinical Isolates/WEI Ying，GUO Yan，BAI Liu，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（18）：-110

【Abstract】 Objective：To investigate the antimcirobial susceptibility of Eravacycline and the distribution of Tetracycline specific resistance genes in Enterococcus faecium clinical isolates.Method：A total of 235 strains of Enterococcus faecium were collected from Shenzhen Nanshan Peoples Hospital and the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University from 2011 to 2016.The antimicrobial susceptibility of the commonly used antbiotics on Enterococcus faecium clinical isolates were determined by the automatic drug sensitivity identification system（BD phonixtm 100），the minimal inhibitory concentration（MIC）of Eravaycline was measured by agar dilution method，polymerase chain reaction（PCR）was carried out to detect the presence of tetracycline specific resistance genes，including tetM，tetL，tetU，tetK，tetS and tetO.Result：Eravacycline exhibitted the good in vitro activity against Enterococcus faecium clinical isolates with the MIC as low as ≤0.5 μg/mL.The presence of tetM+tetL+tetU and tetM+tetL were the most common combination of the Tetracycline resistance genes，indicating the frequency were 18.3%（43/235）and 27.23%（64/235）respectively.Conclusion：The clinical isolates of Enterococcus faecium in China are susceptible to Tetracycline，but the resistance gene on Tetracycline has no effect on Eravacycline.

【Key words】 Enterococcus faecium; Tetracycline specific resistance genes; Eravacycline; Antimicrobial susceptibility

First-authors address：Heilongjiang Medical Service Management Evaluation Center，Harbin 150036，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.18.028

根據(jù)2015年中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)顯示屎腸球菌感染在革蘭陽性菌感染排在第五位。該類細(xì)菌對低濃度氨基糖苷類、頭孢菌素、克林霉素等呈現(xiàn)天然耐藥表型，近年來屎腸球菌對萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺等主要治療藥物耐藥報道逐漸增多，全世界多個地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了耐萬古霉素腸球菌株廣泛流行，這些耐藥株的出現(xiàn)和傳播使屎腸球菌所致重癥感染治療已成為臨床棘手的問題之一[1-2]。因此不斷發(fā)現(xiàn)對屎腸球菌感染治療有效藥物是目前緊迫的問題之一。

既往文獻(xiàn)已證實新型四環(huán)素藥物替加環(huán)素是治療屎腸球菌感染的新型藥物選擇之一[3]。近年剛獲FDA批準(zhǔn)的Eravacycline是新型的四環(huán)素類抗生素，其結(jié)構(gòu)類似于替加環(huán)素，研究表明該藥物可克服四環(huán)素耐藥基因?qū)е碌乃幬锩舾行韵陆担形墨I(xiàn)認(rèn)為包括了外排泵（tetA、tetK、tetL）及核糖體保護(hù)蛋白（tetM、tetO、tetS）等耐藥機制均不影響Eravacycline的藥物敏感性[4]。盡管有研究顯示屎腸球菌四環(huán)素的耐藥率超過60%，Eravacycline對屎腸球菌的具有較好的體外活性[5]，能較好克服tet抗性基因?qū)е碌哪退帲欢覈r見屎腸球菌Eravacycline藥物敏感性研究報道[6]。因此本文研究Eravacycline對我國屎腸球菌的體外敏感性，我國屎腸球菌tet抗性基因分布及對Eravacycline敏感性的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株收集 本研究共收集屎腸球菌株235株臨床分離株（2011年1月-2018年12月），包括深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院收集122株臨床分離株和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院收集的113株（排除同一患者同一部位重復(fù)標(biāo)本），菌株均在30%甘油保存于-80 ℃。菌株分離來源于各種臨床標(biāo)本，包括血液、尿液及膽汁和大便等。

1.2 菌株的復(fù)蘇、鑒定及MIC值檢測 經(jīng)甘油-80 ℃保存，實驗菌株經(jīng)血平板接種復(fù)蘇，質(zhì)譜儀鑒定。屎腸球菌常用抗生素（氨芐西林，萬古霉素，四環(huán)素，利奈唑胺，紅霉素，環(huán)丙沙星，呋喃妥因）藥敏由BD phonixtm 100公司全自動藥敏鑒定系統(tǒng)進(jìn)行測定，抗生素折點參考2017年CLSI規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)判定耐藥（resistance，R），中介（intermediary，I）和敏感（sensitive，S），根據(jù)質(zhì)控菌株ATCC29213質(zhì)控范圍。Eravacycline純品由MCE提供，其藥物敏感性按照CLSI提供的操作方法采用瓊脂稀釋法測定[7]。

1.3 四環(huán)素耐藥基因擴(kuò)增 選擇PCR擴(kuò)增6個四環(huán)素特異性耐藥基因（tetM、tetL、tetU、tetK、tetS和tetO），引物由北京六合華大基因合成，引物序列參考文獻(xiàn)[8]，挑取單克隆菌落加入盛有50 μL DNA裂解緩沖液液（lysis buffer for microorganism to direct pcr）的EP管中，震蕩混勻，80 ℃干燥加熱15 min，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系及條件：2×PCR Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，加蒸餾水21 μL補足至50 μL，tet抗性基因退火溫度為52 ℃，時間30 s，延伸72 ℃，1 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)DNA片段分析。

2 結(jié)果

2.1 屎腸球菌藥敏和Eravacycline敏感性檢測結(jié)

果 屎腸球菌臨床分離株結(jié)果顯示，屎腸球菌對氨芐西林、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、四環(huán)素和紅霉素具有較高耐藥率，對利奈唑胺和萬古霉素具有較好敏感性，耐藥率分別為0.43%（1/235）和0.43%（1/235），各種抗生素耐藥率見表1。Eravacycline MIC值<0.012 5、0.125、0.25和0.5 μg/mL的比例分別為115/235、97/235、20/235和3/235。

2.2 四環(huán)素耐藥基因分布特點及與Eravacycline敏感性之間關(guān)系 結(jié)果提示，181株屎腸球菌攜帶tet抗性基因，其中123株攜帶了兩種以上抗性基因，其中屎腸球菌攜帶四環(huán)素的耐藥基因tetM+tetL比例達(dá)45.5%（包括tetM+tetL+tetU和tetM+tetL兩種組合），攜帶tetM基因有138株，攜帶tetL基因136株，攜帶tetU基因組合的比例為28.57%，攜帶四環(huán)素耐藥基因的菌株四環(huán)素耐藥率顯著升高。Eravacycline對攜帶四環(huán)素耐藥基因菌株表現(xiàn)出良好的活性，3株Eravacycline MIC值為0.5 μg/mL菌攜帶tetM基因。單獨攜帶tetM基因菌株中8/22菌株的Eravacycline MIC值超過0.25 μg/mL。屎腸球菌四環(huán)素耐藥基因，見表2。

3 討論

屎腸球菌是引起臨床感染的革蘭陽性菌屬重要致病菌，是尿路感染的主要致病菌之一，同時也可以導(dǎo)致敗血癥、腹腔感染等危重疾病[7-9]。與同科的鏈球菌相比屎腸球菌耐鹽耐堿，在膽汁培養(yǎng)基可生長，與糞腸球菌相比屎腸球菌對培養(yǎng)基要求營養(yǎng)低，菌落圓形或橢圓形，在豐富的培養(yǎng)基可形成菌落大而光滑。屎腸球菌基因組具有 其特殊性，其對多種抗生素表現(xiàn)為先天耐藥[10-11]，臨床中主要依賴集中有限的幾種抗生素（萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺等）作為其主要治療藥物。

本研究結(jié)果提示屎腸球菌對萬古霉素和利奈唑胺等敏感性較高，但對氨芐西林、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、四環(huán)素和紅霉素等具有較高的耐藥性，這也以往的報道相一致，提示在臨床實踐中萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺等仍是臨床治療的可靠藥物[12-13]。以往有報道屎腸球菌對萬古霉素具有較高的耐藥率，本地區(qū)的地耐藥率提示無萬古霉素耐藥腸球菌株的廣泛流行。利奈唑胺是2001年上市的新型噁唑烷酮類藥物，本醫(yī)院既往報道糞腸球菌具有較高利奈唑胺不敏感率，而本研究表明該藥對屎腸球菌有良好的抑制活性，可能在同一地區(qū)利奈唑胺對糞腸球菌耐藥并不代表其對屎腸球菌敏感性下降。

Eravacycline結(jié)構(gòu)類似于替加環(huán)素和四環(huán)素，屬新型四環(huán)素類抗生素，其分子式對其四環(huán)素核心D環(huán)C7和C9進(jìn)行兩次修飾，其作用機制與四環(huán)素類似，主要通過與細(xì)菌30S小亞基16SRNA結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA轉(zhuǎn)運，阻止肽鏈的延伸發(fā)揮抑制作用。四環(huán)素耐藥基因包括了主動外排機制（tetA、tetK、tetL等蛋白質(zhì)）和核糖體保護(hù)蛋白（tetM、tetO、tetS等蛋白）[14-16]。本研究中Eravacycline對屎腸球菌表現(xiàn)出了良好活性，Eravacycline對氨芐西林、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、四環(huán)素和紅霉素耐藥菌株均具有較低的MIC值，對利奈唑胺和萬古霉素耐藥株均具有較好的敏感性。MIC值均≤0.5 μg/mL，包括對利奈唑胺耐藥屎腸球菌、萬古霉素耐藥屎腸球菌及含有四環(huán)素耐藥基因的屎腸球菌均具有較好的活性。本研究中利奈唑胺耐藥和萬古霉素耐藥屎腸球菌數(shù)量較少，因此Eravacycline對該兩種多重耐藥菌活性仍有待進(jìn)一步研究證實。