新型四環素藥物Eravacycline體外誘導金黃色葡萄球菌耐藥16S rRNA基因突變位點分析

李桂秋　魏影　余治健　陳俊文　鐘婉瑩　陳重

【摘要】 目的：研究Eravacycline體外誘導金黃色葡萄球菌耐藥菌株的核糖體30S亞基16S rRNA基因和核糖體蛋白變異特點，闡明金黃色葡萄球菌Eravacycline耐藥機制。方法：選擇3株金黃色葡萄球菌株，采用Eravacycline不同壓力濃度下逐漸誘導Eravacycline耐藥金黃色葡萄球菌耐藥菌株，挑取誘導菌株單克隆，采用瓊脂平板稀釋法測定母株及誘導系列的Tigecycline和Eravacycline的MIC值;通過PCR擴增其5個拷貝的16S rRNA基因（RR1-RR5）和30S核糖體蛋白基因，將誘導的Eravacycline耐藥株擴增產物測序后與母株序列比較，獲得該基因片段突變位點。結果：經過體外Eravacycline不同濃度梯度多步誘導共挑取6株Eravacycline耐藥菌株，這些菌株的Tigecycline和Eravacycline的MIC值范圍分別為8～16 μg/mL和32～64 μg/mL。16S rRNA基因PCR測序分析提示該基因的主要突變位點分別為RR1（T170G）、RR2（A1124G，G77A）、RR3（C810T）、RR4（G185A，G1036A），30S亞基核糖體蛋白S3蛋白沒有突變，30S亞基核糖體蛋白S10基因多個位點突變。結論：金黃色葡萄球菌Eravacycline誘導耐藥后可導致Tigecycline和Eravacycline的交叉耐藥及16S rRNA基因和30S亞基核糖體蛋白S10位點突變。

【關鍵詞】 MRSA; MSSA; Evacycline誘導耐藥; 16S rRNA基因

Genetic Mutation of 16S rRNA Genes in Eravacycline-resistant Staphylococcus Aureus in Vitro Induced Under Eravacycline Pressure/LI Guiqiu，WEI Ying，YU Zhijian，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（18）：-146

【Abstract】 Objective：To study the mutation characteristics of ribosomal 30S subunit 16S rRNA gene and ribosomal protein in Staphylococcus aureus resistant strains induced by Eravacycline in vitro，to elucidate the resistance mechanism of Staphylococcus aureus Eravacycline.Method：3 strains of Staphylococcus aureus were selected to induce drug-resistant Staphylococcus aureus strains with Eravacycline at different pressure concentrations.Monoclones of the induced strains were selected.The MIC values of Tigecycline and Eravacycline in the mother strain and induction series were determined by agar plate dilution method.5 copies of the 16S rRNA gene（RR1-RR5）and 30S ribosomal protein gene were amplified by PCR.The amplified products of the induced Eravacycline resistant strain were sequenced and compared with the sequence of the parent strain to obtain the mutation site of the gene fragment.Result：6 strains of Eravacycline-resistant strains were selected by multi-step induction with different concentration gradients in vitro，the MIC values of Tigecycline and Eravacycline of these strains ranged from 8 to 16 μg/mL and 32 to 64 μg/mL respectively.PCR sequencing analysis of 16S rRNA gene indicated that the main mutation sites of the gene were RR1（T170G），RR2（A1124G，G77A），RR3（C810T），RR4（G185A，G1036A），30S subunit ribosomal protein S3 protein had no mutation，and 30S subunit ribosomal protein S10 gene had multiple mutations.Conclusion：After Staphylococcus aureus Eravacycline induced drug resistance can lead to cross-resistance of Tigecycline and Eravacycline，mutation of 16S rRNA gene and S10 site of 30S subunit ribosomal protein.

【Key words】 MRSA; MSSA; Evacycline resistance; 16S rRNA gene

First-authors address：Shenzhen Nanshan Peoples Hospital，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.18.038

金黃色葡萄球菌是G+細菌的代表菌，主要分布在人體皮膚表面、鼻咽部和腸道，該細菌通過內外毒素及免疫病理可引起呼吸系統、血流、傷口等組織化膿性感染[1-2]。耐甲西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）是由mecA基因編碼的一種pbp2A蛋白，此蛋白與甲氧西林親和力低，該類細菌臨床治療選擇極為有限，開發金黃色葡萄球菌治療藥物尤其是MRSA治療的有效藥物是臨床的緊迫問題[1]。

四環素類抗生素作用于細菌核糖體30S亞基，體外晶體結構分析四環素的作用機制是與30S小亞基16S rRNA和核糖體蛋白相互作用，阻止氨基酰-tRNA轉運從而干擾蛋白質合成[2-3]。Tetrapnase制藥公司研發的新型四環素類抗生素Eravacycline結構類似于替加環素，對G+細菌具有良好抑制活性和最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，目前尚無金黃色葡萄球菌臨床耐藥株的報道[4]。因此本實驗利用Eravacycline體外誘導金黃色葡萄球菌耐藥株，通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增核糖體基因并測序分析，觀察體外誘導Eravacycline誘導的耐藥株是否和tigecycline存在交叉耐藥以及是否在30S亞基的16S rRNA基因和核糖體蛋白S10基因上出現變異位點，揭示金黃色葡萄球菌Eravacycline耐藥的潛在規律。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株的復蘇鑒定及Eravaycycline耐藥菌誘導 將

2株MSSA（編號MS7和MS8）和1株MRSA菌株（編號MR2）采用血平板復蘇，由BD phonixtm 100公司全自動藥敏鑒定系統和質譜儀鑒定菌種，質控菌株為ATCC29213[5]。

1.2 體外誘導Eravacycline耐藥金黃色葡萄球菌 將

3株金黃色葡萄球菌分別接種到MH平板培養基中復蘇。挑取單克隆菌落，根據母株的MIC值，誘導的起始濃度為1/2MIC的Eravacycline（MCE公司），誘導濃度為1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC，各濃度梯度誘導4～8代，誘導下一梯度時需接平板質譜鑒定，當細菌生長抑制時需降低化合物濃度重復傳代培養，每代37 ℃培養12～14 h，誘導終止時挑取單克隆用無抗血平板篩查傳3代，進行MIC值測定和DNA提取及PCR[6]。

1.3 MIC值的檢測 按美國CLSI2017年規定的標準，采用瓊脂平板稀釋法檢測3株母株及相對應的6株誘導株的Tigecycline和Eravacycline的MIC值。

1.4 16S rRNA基因片擴增和測序 16S rRNA的5個拷貝基因片段：RR1（2 086 bp）、RR2（2 075 bp）、RR3（1 936 bp）、RR4（1 756 bp）和RR5（2 345 bp）。

引物委托北京六合華大基因公司合成（引物Primer 5.0軟件設計，引物序列見表1）。采用TAKARA試劑盒提取菌株基因組DNA，-20 ℃保存備用。采用PCR方法檢測基因RR1、RR2、RR3、RR4和RR5，擴增條件如下：反應體系50 μL，Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）25 μL，Forward primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，Template DNA 2 μL，加dd H2O補齊至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95℃變性30 s，RR1、2、3、4、5，S3，S10的退火溫度分別為50 ℃，49 ℃，51 ℃，RR1、2、3、4、5，S3，S10的延伸時間分別為2 min，1 min，1 min，共35個循環，72 ℃后延伸10 min，PCR產物于4 ℃保存。PCR反應產物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳，對電泳陽性產物送華大基因公司測序，測序結果采用DNAMAN比對誘導株和拷貝16S rRNA序列與野生株間差異尋找變異位點。同樣方法擴增30S核糖體亞基蛋白S3和S10，通過變異株和母株基因比對尋找耐藥相關變異位點。

2 結果

2.1 耐藥株鑒定及MIC值測定 結果顯示，3株金葡誘導前均對Eravacycline敏感;3株母株菌經過多步法體外誘導后，其Eravacycline MIC值顯著增高，得到不同MIC值梯度的菌株，Eravacycline MIC值達8～16 μg/mL;Eravacycline耐藥株的Tigecycline MIC值波動在32～64 μg/mL，見表2。

2.2 16S rRNA基因和核糖體蛋白測序分析 變異位點3株母株和誘導耐藥株的16S rRNA基因比對提示主要突變位點分別為RR1（T170G）、RR2（A1124G，G77A）、RR3（C810T）、RR4（G185A，G1036A），其中30S核糖體蛋白S3沒有突變，30S核糖體蛋白S10蛋白基因41、47、87位點突變，見表3。

3 討論

既往有研究報道了我國金黃色葡萄球菌臨床分離株Eravacycline的敏感性及異質性耐藥發生比例，提示Eravacycline對于臨床株具有較好的敏感性[7-8]，目前尚無金黃色葡萄球菌中Eravacycline耐藥株的報道，但對于異質性耐藥的發生值得臨床密切關注并深入研究。本研究選擇Eravacycline對3株金黃色葡萄球菌進行誘導耐藥實驗，結果提示獲得Eravacycline高濃度耐藥株。Eravacycline為FDA2018審批通過的新型抗生素，目前折點對于金黃色葡萄球菌的推薦為0.5 μg/mL，本研究獲得的Eravacycline誘導金黃色葡萄球菌株的MIC值遠遠高于這一折點，因此通過體外誘導成功獲得Eravacycline耐藥金黃色葡萄球菌菌株。

細菌對四環素耐藥機制主要為通過外排泵主動外排;通過核糖體保護蛋白解離;通過對四環素的酶解作用。既往多項研究提示核糖體30S亞基16S rRNA和核糖體蛋白S3及S10變異與四環素類耐藥密切相關[9-11]。細菌含有多個16S rRNA拷貝，不同細菌研究提示四環素導致的16S rRNA基因變異位點在不同拷貝的16S rRNA變異位點并不一致，這可能與四環素作用的空間結構復雜密切相關。Eravacycline因為特殊的基團免疫這些抵抗機制[12-13]。

本研究經Eravacycline誘導耐藥后的3組誘導菌株與母株經16S rRNA基因測序后發現，金黃色葡萄球菌16S rRNA的5個拷貝中不同細菌的RR1、RR2、RR3、RR4間有共同突變位點，RR5無規律，30S亞基核糖體蛋白S10基因突變無規律。文獻[14-15]結果提示替加環素誘導金黃色葡萄球菌16S rRNA變異與本研究結果一致，因此在新型替加環素等藥物誘導下細菌16S rRNA基因變異規律及其意義仍有到進一步研究。本研究提示通過體外誘導金黃色葡萄球菌可獲得Eravacycline耐藥菌株，這類菌株同時對Tigecycline產生耐藥性;隨著Eravacycline藥物壓力增加和時間延長，其MIC值會增加;Eravacycline誘導可以導致16S rRNA基因突變和核糖體蛋白S3和S10突變，這些位點突變與耐藥的臨床意義和規律仍有待進一步研究揭示。

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