補骨脂酚對光老化HSF細胞保護作用研究

劉國良 姚遠 張寧 郭瑋 王瑤 劉斌

[摘要] 目的 研究補骨脂酚對中波紫外線（UVB）照射誘導的光老化人皮膚成纖維細胞（HSF）的保護作用。 方法 體外培養HSF細胞，分為空白組（正常培養，不進行UVB輻射）、UVB模型組（UVB輻射）、雌二醇組及補骨脂酚低（1 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（100 μmol/L）劑量組。采用MTT法檢測細胞活力;采用Western blot法檢測細胞內Ⅰ型膠原蛋白（COL Ⅰ）、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）和基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）的表達量;采用逆轉錄PCR法（RT-PCR）檢測細胞COL Ⅰ、MMP-1 mRNA的表達水平。 結果 確定光老化HSF細胞模型的最佳UVB照射劑量為25 mJ/cm2。與空白組比較，補骨脂酚低、中、高劑量組細胞活力及MMP-1、MMP-3、COL Ⅰ分泌差異無統計學意義（P > 0.05）;UVB模型組的細胞活力、COL Ⅰ的表達水平顯著下降（P < 0.05），MMP-1和MMP-3的表達水平顯著上升（P < 0.05）;MMP-1 mRNA表達水平升高、COL Ⅰ mRNA表達水平下降（P < 0.05）。與UVB模型組比較，補骨脂酚低、中、高劑量組細胞活力、COL Ⅰ的表達量顯著上升（P < 0.05），MMP-1和MMP-3的表達水平顯著下降（P < 0.05），MMP-1 mRNA表達下降、COL Ⅰ mRNA表達上升（P < 0.05）。 結論 補骨脂酚能夠促進HSF細胞COL Ⅰ表達，抑制MMP-1與MMP-3的表達，防護UVB對HSF細胞的損傷，發揮抗皮膚光老化的作用。

[關鍵詞] 中波紫外線;補骨脂酚;成纖維細胞;植物雌激素;光老化

[中圖分類號] R965.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（a）-0011-06

Study on protective effect of bakuchiol on photoaging HSF cells

LIU Guoliang1? ?YAO Yuan1? ?ZHANG Ning1? ?GUO Wei2? ?WANG Yao2? ?LIU Bin1

1.College of Jiamusi， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Jiamusi? ?154007， China; 2.the First Clinical Medical College， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China

[Abstract] Objective To study the protective effect of bakuchiol on photoaging human skin fibroblasts （HSF） induced by ultraviolet radiation B （UVB） irradiation. Methods HSF cells were cultured in vitro and divided into blank group （normal culture， no UVB radiation）， UVB model group （UVB radiation）， estradiol group and bakuchiol low （1 μmol/L）， medium （10 μmol/L） and high dose （100 μmol/L） groups. Cell viability was detected by MTT assay. The protein expressions of type Ⅰ collagen （COL Ⅰ）， matrix metalloproteinase-1 （MMP-1） and matrix metalloproteinase-3 （MMP-3） were detected by Western blot. The expression levels of COL Ⅰ and MMP-1 mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results The optimal UVB radiation dose for photoaging HSF cell model was 25 mJ/cm2. Compared with the blank group， there was no significant difference in cell viability and secretion of MMP-1， MMP-3 and COL Ⅰ between the low， medium and high dose groups of bakuchiol （P > 0.05）; the cell viability and COL Ⅰ expression level in the UVB model group decreased significantly （P < 0.05）， the protein expression levels of MMP-1 and MMP-3 increased significantly （P < 0.05）; the mRNA expression levels of MMP-1 and COL Ⅰ decreased significantly （P < 0.05）. Compared with the UVB model group， the cell viability and COL Ⅰ expression in the low， middle and high dose groups of bakuchiol increased significantly （P < 0.05）， the protein expression levels of MMP-1 and MMP-3 decreased significantly （P < 0.05）， the mRNA expression levels of MMP-1 and COL Ⅰ increased significantly （P < 0.05）. Conclusion Bakuchiol can promote the expression of COL Ⅰ in HSFs， inhibit the expression of MMP-1 and MMP-3， protect UVB from damage to HSFs and exert anti-photoaging effects on skin.

[Key words] Ultraviolet radiation B; Bakuchiol; Fibroblasts; Phytoestrogen; Photoaging

由于地球臭氧層遭到破壞，加之戶外活動隨著人們生活水平的提高而增加，過分暴露在紫外線下導致皮膚光老化[1]。皮膚光老化可導致皮膚干燥、毛細血管擴張、色素沉著斑、甚至惡性腫瘤[2]。光老化皮膚的主要組織學特征是皮膚真皮層基質構成的改變，即膠原成分的減少和異常彈性纖維沉積[3]。雌激素對抗皮膚衰老效果顯著，但長期應用雌激素易產生皮膚色素沉著、婦科腫瘤、高凝血、高血壓等副作用[5]。植物雌激素是天然存在于某些植物中、具有雌激素效能的一類化合物。其因與雌激素結構類似，可以與體內雌激素受體結合模擬、干擾雌激素的生理生化作用[6]。體內雌激素水平較低時，其具有擬雌激素作用[7];體內雌激素水平較高時，其可發揮抗雌激素活性。因此，植物雌激素稱為“選擇性雌激素受體調節劑”。

中藥補骨脂在治療光老化方面具有顯著效果[8]，而補骨脂富含多種植物雌激素成分。在前期研究基礎上，本研究從補骨脂中篩選出多種植物雌激素成分，其中以補骨脂酚的雌激素樣活性最強，且在治療光老化方面具有良好的效果，但其抗光老化作用機制尚未闡明。本研究以揭示植物雌激素抗皮膚光老化的作用機制為目的，選擇確切具有雌激素樣作用的植物雌激素補骨脂酚為研究對象，圍繞調節人皮膚成纖維細胞增殖能力及膠原合成與降解相關蛋白表達這一分子機制，開展植物雌激素抗光老化機制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人皮膚成纖維細胞（HSF，北京協和細胞中心提供）;補骨脂酚（南京澤朗科技有限公司，生產批號：072815）;鼠抗人MMP-1單克隆抗體（Santa Cruz公司，生產批號：20170513）;鼠抗人MMP-3單克隆抗體（Santa Cruz公司，生產批號：20170526）;鼠抗人I型膠原單克隆抗體（Santa Cruz公司，生產批號：20170521）;兔抗鼠β-actin單克隆抗體（Santa Cruz公司，生產批號：20170216）。

1.2 儀器

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-10C）;紫外光療儀（希格瑪，ss-03）;二氧化碳培養箱（上海印溪儀器儀表有限公司，LHH.CP-150）;酶標儀（上海熱電儀器有限公司，SuPerMax 3100）;凝膠成像系統（BIO-RAD 公司，ChemiDocTM XRS+）。

1.3 試藥配制

雌二醇藥液制備：分析天平精密稱取雌二醇5.5 mg，4 mL無水乙醇溶解，500 μL吐溫-80助溶，950 mL 細胞培養基（DMEM）完全培養液混勻容量瓶定容至1 L，配制成20 μmol/L的母液，稀釋至終濃度10-3 μmol/L，調節pH至6.8，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

補骨脂酚藥液制備：分析天平精密稱取補骨脂酚2.6 mg，用DMEM完全培養液溶解定容至100 mL，配制成200 μmol/L的母液，稀釋成1000、500、100、10、1 μmol/L梯度濃度藥液，調節pH至6.8，0.22 μm微孔濾膜濾過除菌。

1.4 人皮膚成纖維細胞培養

將細胞稀釋至3×105個/mL，將細胞懸液按1 mL/孔加入至6孔細胞培養板，20 μL/孔接種于96孔板中，置于CO2培養箱中孵育培養過夜。

1.5 造模

UVB照射劑量分別給予0、15、25、35、45 mJ/cm2。UV劑量=UV輻照強度×時間（s）強度。照射時，UV組96孔培養板離燈管8 cm。每孔加80 μL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）防止組織變干，照射完畢后PBS液清洗細胞2次，繼續培養24 h，采用MTT法檢測。

1.6 給藥

細胞接種96孔培養板中，細胞生長至80%左右融合時，血清饑餓24 h后，加入高（100 μmol/L）、中（10 μmol/L）、低劑量（1 μmol/L）補骨脂酚孵育24 h，UVB照射，繼續培養24 h，棄上清液，收集細胞;或繼續培養48 h后，收集上清液，-20℃保存，待檢測。空白組則在相同培養條件下培養，且未經UVB照射。

1.7 MTT法檢測細胞活力

96孔板中HSF接受不同濃度補骨脂酚預處理24 h，再照射相應劑量UVB。繼續孵育24 h后，從CO2培養箱中取出96孔板，吸棄培養基，每孔加入90 μL新鮮培養基及10 μL 5 mg/mL MTT。將96孔板置于CO2培養箱中繼續孵育培養4 h。吸棄培養基，每孔加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩混勻10 min。用酶標儀測定570 nm處的吸光值，計算細胞活力。

1.8 Western blot法檢測細胞蛋白表達

從CO2培養箱中取出藥物處理過的6孔板，按100 μL/孔加入RIPA裂解液，轉移至1.5 mL EP管中，冰上孵育30 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，將上清轉移至1.5 mL離心管中。電泳：濃縮膠電壓為80 V，電泳2 h。轉膜：恒壓80 V轉移60 min。封閉：封閉液室溫封閉2 h。一抗孵育：一抗（1∶500稀釋）及內參蛋白β-actin一抗（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。二抗孵育∶二抗（1∶1000稀釋），在搖床上室溫孵育1 h。ECL發光：等量的A液和B液按1∶1混合。作用1 min左右，將膜放入化學發光成像儀內，曝光照相及圖像分析。

1.9 RT-PCR法檢測基因表達

從CO2培養箱中取出經實驗分組給藥處理過的6孔板，按1 mL/孔加入Trizol試劑，室溫靜置2 min，用移液器將細胞懸液轉移至無RNAase的1.5 mL的EP管中。按0.2 ml/mL Trizol比例加入氯仿。室溫靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，將上層溶液小心轉移至新的EP管中。室溫靜置10 min后，4℃、12 000 r/min離心15 min。向含有沉淀的EP管中加入1 mL于-20℃預冷的75%乙醇，輕輕上下顛倒，洗滌沉淀，4℃、12 000 r/min離心5 min。移液器除去上清液，室溫放置5 min，干燥，用30 μL RNase-free水溶解沉淀。逆轉錄反應：總RNA溶液稀釋至200 ng/μL。逆轉錄反應在PCR儀中進行，反應條件：70℃ 5 min， 37℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min。反應結束后，將cDNA溶液放置于4℃保存（長期保存置于-20℃）。

在冰水浴上的PCR管中依次加入樣品、16.1 μL ddH2O、1.5 μL cDNA、2.5 μL 10×PCR Buffer、2.5 μL dNTP、1.3 μL MgCl2，最后加入0.1 μL Taq酶，各0.5 μL上游引物和下游引物，使PCR管內終體積達到25 μL。將PCR管放入PCR擴增儀上擴增。引物的設計與合成由上海生工生物工程技術服務有限公司提供，以GAPDH為內參照。見表1。

1.10 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UVB照射劑量測定

照射劑量<25 mJ/cm2，基本不影響成纖維細胞的活力;照射劑量>25 mJ/cm2，明顯抑制細胞活性。提示25 mJ/cm2開始對成纖維細胞造成損傷，且隨著劑量的增大，細胞活力降低更明顯，呈劑量依賴性，UVB照射（25 mJ/cm2）對HSF細胞沒有明顯細胞毒性作用。因此，本研究選擇UVB（25 mJ/cm2）進行實驗。見表2。

2.2 補骨脂酚對正常HSF細胞增殖的影響

補骨脂酚在100 μmol/L以下，不影響HSF細胞活性，與空白組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;在500 μmol/L以上時，顯著抑制HSF細胞活性，與空白組比較，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。本研究選擇補骨脂酚1、10、100 μmol/L進行實驗。見表3。

2.3 補骨脂酚對光老化HSF細胞增殖的影響

與空白組比較，UVB照射（25 mJ/cm2）后HSF細胞活力顯著下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與UVB模型組比較，補骨脂酚低、中、高劑量組（1、10、100 μmol/L）HSF細胞活力顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.01）。見圖1。

2.4 補骨脂酚對光老化HSF細胞MMP-1、MMP-3蛋白表達的影響

與空白組比較，UVB模型組HSF細胞中MMP-1和MMP-3蛋白表達量顯著增加，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與UVB模型組比較，雌二醇組和補骨脂酚高、中、低劑量組HSF細胞中MMP-1和MMP-3蛋白表達量顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖2～3。

2.5 補骨脂酚對光老化HSF細胞COLⅠ表達的影響

與空白組比較，UVB模型組COLⅠ蛋白表達水平顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與UVB模型組比較，雌二醇組和補骨脂酚高、中、低劑量組COL Ⅰ蛋表達水平顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖4。

2.6 補骨脂酚對光老化HSF細胞MMP-1、COLⅠ mRNA表達的影響

與空白組比較，UVB模型組MMP-1 mRNA表達水平顯著升高，COLⅠ mRNA表達水平顯著下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與UVB模型組比較，補骨脂酚低、中、高劑量組HSF細胞中MMP-1 mRNA表達水平顯著下調，COLⅠ蛋白mRNA表達水平顯著上調，差異有高度統計學意義（P < 0.01）;與雌二醇組比較，補骨脂酚低、中劑量組MMP-1 mRNA 表達水平顯著上調，COLⅠ蛋白mRNA表達水平顯著下調，差異有統計學意義（P < 0.05），補骨脂酚高劑量組MMP-1和COLⅠ蛋白mRNA表達水平差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖5、表4。

3 討論

光老化是皮膚暴露在紫外線下而引起的皮膚結構和功能的改變[9]。皮膚光老化導致皮膚粗糙、增厚、松弛、深而粗的皺紋，局部有過度的色素沉著或毛細血管擴張，甚至可能引起惡性腫瘤（如日光角化病、鱗狀細胞癌、惡性黑素瘤等）[10]。紫外線導致的膠原纖維減少是皮膚光老化的重要原因，COLⅠ是皮膚真皮層主要的細胞外基質成分，約占人體真皮蛋白質總量的90%，膠原蛋白的變化主要是由基質金屬蛋白分解而引起，MMPs在膠原降解和光老化發生起著重要作用，其中MMP-1、MMP-3是降解COLⅠ的主要酶[11-12]。

雌激素在對抗皮膚衰老方面作用顯著，但長期應用雌激素易產生皮膚色素沉著、婦科腫瘤、高凝血、高血壓等副作用[13-14]。中藥植物雌激素是一類結構與雌激素相似的多羥基化合物，能夠與雌激素受體結合發揮雌激素樣作用，又可以與內源性雌激素競爭雌激素受體，從而發揮抗雌激素作用，抑制雌激素的副作用，其有望成為雌激素抗皮膚光老化的替代品[15-16]。

補骨脂酚是一種植物激素，具有抗衰老、抗氧化和抗凋亡等多種生物學活性[17-18]，而對光老化的保護作用尚未見到報道。UVB波長短，穿透力強是造成皮膚光老化的主要原因。因此，本研究以UVB為光源，以人成纖維細胞為研究對象，參照大量實驗研究和眾多參考文獻[19-20]的報道進行體外培養人成纖維細胞光老化模型的構建，并以此模型研究補骨脂酚的抗光老化作用。

本研究結果提示，UVB照射后HSF細胞增殖得到抑制，細胞中COL Ⅰ蛋白含量降低，而MMP-1、MMP-3含量增加，這與任捷[21]的研究結果一致，提示UVB照射后影響HSF細胞增殖，導致膠原蛋白合成減少，同時分解增加而導致皮膚光老化。補骨脂酚干預后，可降低UVB對HSF細胞的損傷作用，降低UVB對細胞增殖的影響，增加COLⅠ的合成以及mRNA的表達，下調MMPs蛋白的合成及mRNA的表達，從而降低膠原的分解，增加HSF細胞COLⅠ合成，最終起到防治HSF細胞光老化的作用。

植物雌激素樣物質補骨脂酚具有防護皮膚光老化作用。在后續實驗中，我們將針對其作用靶點進行預防光老化作用機制研究，以植物雌激素與雌激素受體相互作用及相關信號通路進行全面深入的研究，為植物雌激素預防皮膚光老化藥物的開發奠定基礎。

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