細胞外囊泡對腫瘤生物學特性的影響研究進展

賀玲 張小燕 楊雅芝 李劍

[摘要] 腫瘤的生長、侵襲和轉移依賴于腫瘤細胞與其所處微環境中基質細胞的“交叉對話”，這種“交叉對話”主要涉及這兩種細胞的可溶因子的分泌、膜包囊顆粒的釋放以及細胞與細胞間的直接接觸。這些膜包囊顆粒被稱為細胞外囊泡（EVSs），腫瘤細胞比正常細胞可分泌更多的EVSs，這些EVSs通過依賴于內體分選復合物蛋白（ESCRT）和不依賴于ESCRT的途徑將蛋白質、DNA、RNA等“內容物”分選入體內。這些“內容物”促進腫瘤細胞與基質細胞之間的信息的轉遞，從而支持腫瘤血管生成，侵襲轉移、耐藥及使得腫瘤細胞獲得惡性表征。

[關鍵詞] 細胞外囊泡;信號分選;腫瘤微環境;腫瘤-基質細胞

[中圖分類號] R730.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（a）-0062-04

Advance in research on the effects of extracellular vesicles on the biological characteristics of tumor

HE Ling1? ?ZHANG Xiaoyan2? ?YANG Yazhi3? ?LI Jian3

1.Clinical Department， Jiangxi Health Vocational College， Jiangxi Province， Nanchang? ?330052， China; 2.Medical College of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang? ?330006， China; 3.Key Blood Laboratory， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang? ?330052， China

[Abstract] Tumor growth， invasion and metastasis depend on the "cross-talk" between tumor cells and stromal cells in their microenvironment， which mainly involves the secretion of soluble factors of these two kinds of cells， the release of membrane-tomont particles and the direct contact between cells. These vesicles are known as extracellular vesicles （EVSs）， and tumor cells secrete more EVSs than normal cells， which separate proteins， DNA， RNA， and other "contents" into the body through both escrt-dependent and escrt-independent pathways. These "contents" facilitate the transmission of information between tumor cells and stromal cells， thus supporting tumor angiogenesis， invasion and metastasis， drug resistance， and malignant characterization of tumor cells.

[Key words] Extracellular vesicles; Signal sorting; Tumor microenvironment; Tumor-stroma cell

細胞外囊泡（EVSs）是由脂質雙分子層包繞形成的球狀膜性囊泡，通過細胞分泌產生，包括外泌體、膜微粒、微囊泡及凋亡小體等。細胞間可以通過釋放EVSs進行“交叉對話”，這些EVSs可以聯系并改變相鄰或遠處靶細胞的行為。EVSs通過介導微環境中腫瘤和基質細胞之間的相互作用促進腫瘤的進展。本文將探討EVSs的產生及體內攜帶物的分選機制，以及這些過程如何在腫瘤中失去“調控”，并因此改變了EVSs的生物學特性，及如何影響腫瘤的生物學特性。

1 EVSs的產生

EVSs能選擇性地將母細胞來源的多種生物活性物質包裝進其雙分子層膜結構中或攜帶于膜表面或包裹入其囊泡，如脂質、細胞因子、特異性及非特異性蛋白、DNA、RNA等。目前關于EVSs形成、釋放及EVSs內成分被分選進入腔內囊泡的具體機制仍不清楚。在對外泌體的研究中發現，其生成有依賴于轉運必需內體分選復合物蛋白（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）和不依賴于ESCRT的途徑。ESCRT包括ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ等4個可溶性多蛋白復合體以及Vps4-Vta1復合物[1]。在依賴于ESCRT的外泌體生成途徑中，由泛素標記的蛋白質被轉運到內體膜上，其通過ESCRT系統導致內體膜的內陷，從而將蛋白質組分釋放到內體腔內形成內腔囊泡。ESCRT-0的功能是識別和富集底物，同時識別被泛素修飾的靶蛋白。當靶蛋白定位富集后，ESCRT-Ⅰ中的TSG101蛋白被招募至泛素化的蛋白質上形成復合體，并激活ESCRT-Ⅱ。激活的ESCRT-Ⅱ能導致ESCRT-Ⅲ復合體在出芽體頸部的寡聚，并且剪切芽體使得小泡釋放至內體腔中，形成多囊泡體。最后，在Vps4的協助下，ESCRT-Ⅲ復合體從內體膜上解聚釋出[2]。某些外泌體中的蛋白質釋放并不依賴于ESCRT復合體，Trajkovic等[3]研究發現，在少突神經細胞中，載脂蛋白PLP分選進入外泌體和釋放，并不依賴于TSG101蛋白和ALIX蛋白，而是與神經酰胺有關。含有特定含量神經酰胺的脂筏結構決定外泌體的生成水平。同時，另外一些特定的脂筏結構和高度有序的低聚反應，會決定外泌體中的蛋白質成分。在樹突狀細胞中，MHC-Ⅱ被分選至外泌體中，需要含有CD9脂筏結構的協助[4]。由抗體交叉反應引起的低聚反應會增強免疫蛋白進入外泌體。總之，這些研究結果提出了一個主要問題，即不同的分選機制是否能將特定分子并入EVSs或是否存在攜帶不同“貨物”的不同囊泡亞群。因此，干擾特定的分選機制可能影響腫瘤細胞釋放的EVSs或EVSs亞型，并影響腫瘤微環境中的腫瘤-基質細胞交流。

2 胞外囊泡“貨物”

EVSs在腫瘤微環境中的功能特性取決于它們裝載“貨物”以及它們的釋放和攝取的動力學。鑒定腫瘤EVSs的促腫瘤“成分”以及導致它們并入囊泡的途徑是當前該領域中的研究熱點之一。

2.1 蛋白質

在EVSs產生過程中，蛋白質通過直接與四跨膜蛋白的結合或通過包埋在富含四跨膜蛋白的微域中的方式，促進它們分選到EVSs中。由于腫瘤外泌體攜帶促腫瘤發生發展的重要蛋白，如癌蛋白、生長因子和免疫調節分子等。因此，通過干擾特定蛋白質加載到囊泡的蛋白-蛋白相互作用網絡中，可提供一種靶向干擾的方式來削弱EVSs的致癌能力。

2.2 RNA

2006年，Ratajczak[5]等首先提出了供體和受體細胞之間的RNA水平轉移。隨后，Valadi等[6]證明了由EVSs運輸的mRNA分子實際上可以翻譯成蛋白質，從而為細胞之間遺傳物質水平轉移提供了證據。除mRNA外，外泌體內的小非編碼RNA通過基因調節也可發揮功能。第一個提供通過外泌體功能性轉移小RNA的證據是，2010年，Pegtel等[7]使用EB病毒感染B細胞時發現小RNA（miRNA）通過外泌體分泌并可調節受體樹突細胞中的基因表達。盡管某些EVSs相關miRNA在腫瘤中具有明顯的作用，但它們通過EVSs轉移負責促進體內腫瘤進展的確切證據仍然缺乏。事實上，很難區分到底是由EVSs-介導轉移的miRNA還是受體細胞中的內源性miRNA表達所起的作用。Thomou等[8]最近提供了一個引人注目的體內EVSs介導的miRNA轉移實驗。作者使用特異性切酶敲除的小鼠模型證實，棕色脂肪是EVSs相關循環miRNA的主要來源。將正常脂肪組織移植到該小鼠中不僅可以恢復EVSs miRNA的循環水平，而且可以調節其在遠端器官中的基因表達。目前已經發現許多已知的RNA結合蛋白（RBP）可介導RNA分選進入外泌體內，但這些蛋白如何連接到內體系統仍是未知數。

2.3 DNA

研究[9]報道，EVSs中存在片段化基因組DNA（gDNA）、線粒體DNA（mtDNA）、寄生DNA等。盡管這些DNA并入EVSs中的機制仍有待闡明，但EVSs中gDNA片段均勻分布于整個基因組的事實表明分選存在隨機性。然而，由于所有研究均依賴超速離心法作為外泌體純化方法，因此難以完全排除DNA被主動分選到外泌體中的證據，因為使用這種分離方法很難區分囊泡、蛋白質復合物和凋亡小體。EVSs相關DNA可存在于EVSs表面上。

目前，關于EVSs進行DNA轉移的生理意義還不清楚。研究[10]表明，DNA損傷后，基因組DNA片段可以輸出到細胞質，在那里它們可以觸發細胞質DNA傳感器，導致細胞衰老或凋亡。EVSs分泌的DNA片段可阻止細胞質DNA傳感器的激活，從而有助于細胞穩態[11]。

3 腫瘤EVS釋放機制失調

大量證據[12-13]表明，與正常細胞比較，腫瘤細胞釋放更多量的EVSs，無論細胞內在信號還是外在環境信號都可以增強腫瘤細胞釋放EVSs。如：腫瘤細胞內在信號RalB的超活化、YKT6的過度表達和Rho-ROCK信號的升高都可增強腫瘤細胞EVSs產生。活化EGFRvⅢ和H-RASV12信號傳導途徑也可以增加腫瘤細胞的EVSs產生。此外，研究[14]表明，原癌基因SRC通過磷酸化多配體蛋白聚糖和syntenin的胞質結構域特異性刺激外泌體生物合成途徑。腫瘤細胞除了比正常細胞可釋放更多的EVSs之外，其所“裝載”的蛋白質和RNA也是不同的，這種結果的產生可能是由于致癌信號的活化或是微環境條件的改變所致。腫瘤細胞EVSs釋放和裝載的“貨物”影響了腫瘤微環境中乃至遠處轉移部位的腫瘤和基質之間的“交叉對話”。

4 EVSs在腫瘤中的作用

4.1 腫瘤-基質細胞的“對話”

腫瘤EVSs改變了局部的或募集到的基質細胞，產生有利于腫瘤生長的微環境，從而支持腫瘤血管生成、免疫抑制和腫瘤細胞獲得惡性表征。腫瘤衍生的EVSs可以抑制CD8+細胞的增殖和活化，同時促進調節性T細胞的擴增。除了它們對適應性免疫系統的作用之外，腫瘤EVSs還可以將先天免疫成分“教育”為致癌表型。例如，腫瘤EVSs表面上的Hsp72通過TLR2依賴性機制誘導IL-6/Stat3信號通路來激活骨髓衍生的抑制細胞[15]。Nabet等[16]證實，前列腺癌細胞釋放的EVSs觸發誘導血管生成的肌成纖維細胞分化并加速體內腫瘤生長，這些效應是由囊泡表面的TGFβ介導的。與這一發現一致的是，Webber等[17]最近發現骨腫瘤細胞釋放的EVSs攜帶高水平的膜相關的TGFβ，通過活化STAT3信號通路，誘導間充質干細胞（MSC）釋放IL-6及促進腫瘤的轉移，這表明由腫瘤EVSs在腫瘤微環境內啟動的炎癥環節增強了腫瘤細胞的轉移行為。除了對基質細胞的影響外，EVSs還通過作用于細胞外基質有助于腫瘤的進展。Baglio等[18]報道腫瘤外泌體通過分泌纖維連接蛋白增強細胞的定向運動。隨后他們又證明了腫瘤外泌體不僅增強細胞遷移速度，而且促進趨化梯度的定向運動，但確切的機制尚不清楚。

4.2 基質-腫瘤細胞的“對話”

腫瘤-基質的交流主要集中在腫瘤EVSs改變基質細胞行為的單向過程。然而，2017年，Feng等[19]研究表明，成纖維細胞衍生的囊泡可激活自分泌的Wnt信號通路，從而增強腫瘤細胞的運動和轉移。從那以后，有研究表明基質EVSs控制著腫瘤進展的多個方面，包括獲得侵襲性的表型，耐藥等，如：Nabet等[16]研究表明，在母體細胞內，pol-Ⅲ轉錄物主要與RNA結合成伴侶，這些伴侶阻止它們被細胞內傳感器識別。在特定條件下，可以將這些RNA分子整合到外泌體中，并在傳送到受體細胞時激活模式識別受體（PRR）和刺激相關基因（ISG）表達。Godlewski等[20]的研究表明，這種機制與促進腫瘤進展的腫瘤-基質通訊密切相關。Zhang等[21]的研究進一步證實了EVSs相關RNA在基質-腫瘤通訊中的作用。其結果表明，人類乳腺癌細胞在播散到大腦時下調基質細胞的腫瘤抑制基因PTEN表達，但這種情況不會出現在其他轉移部位;進一步體內實驗證明星形膠質細胞來源的EVSs通過轉移miRNA-19a，可下調腫瘤細胞PTEN的表達。這項研究再次確認了基質EVSs在腫瘤細胞與宿主環境之間的作用。未來的研究應該旨在了解這種模型是否可以擴展到其他器官轉移灶形成的研究。最近發現基于線粒體DNA轉移的一種新型的EVSs通訊方式與耐藥性有關。有研究[9，22-23]發現腫瘤相關的成纖維細胞衍生的EVSs，可恢復激素療法誘導的乳腺癌干細胞的休眠和對激素療法的抵抗。這項原創工作提出了多個問題：哪個EVSs子類負責線粒體基因組的轉移？線粒體DNA如何并入EVSs？最重要的是，線粒體DNA如何在功能上轉移到正確的亞細胞位置并恢復受體細胞的代謝活性？雖然許多方面需要進一步明確，但這項研究揭示了一種新型的腫瘤代謝通訊方式。

5 結語

腫瘤的生長、侵襲和轉移依賴于腫瘤細胞與其所處微環境中基質細胞的“交叉對話”，這種“交叉對話”主要涉及這兩種細胞的可溶因子的分泌、膜包囊顆粒的釋放以及細胞與細胞間的直接接觸。EVSs在這種交叉對話中起重要作用。EVSs通過不同的分選機制將蛋白質、DNA、RNA分選入EVSs體內。EVSs體內攜帶的這些物質可以促進腫瘤細胞的生長，促進新生血管的生成，進行間質細胞間的轉化，可以利用腫瘤的微環境為其轉移提供必要條件。目前，干擾EVSs的產生，貨物裝載和/或功能。這是不易的，因為正如本綜述中所描述的那樣，存在多種可能的機制，并且對EVSs亞群的性質和功能還不是很清楚。不過，隨著對EVSs各種機制研究的不斷深入，EVSs將更好地滿足臨床治療需求，開發腫瘤治療新手段。

[參考文獻]

[1]? Henne WM，Buchkovich NJ，Emr SD. The ESCRT pathway [J]. Dev Cell，2011，21（1）：77-91.

[2]? Wang Q，Lu Q. Plasma membrane-derived extracellular microvesicles mediate non-canonical intercellular NOTCH signaling [J]. Nat Commun，2017，8（1）：709.

[3]? Trajkovic K，Hsu C，Chiantia S，et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes [J]. Science，2008，319（5867）：1244-1247.

[4]? van Niel G，Wubbolts R，Broeke T，et al. Dendritic cells regulate exposure of MHC class II at their plasma membrane by oligoubiquitination [J]. Immunity，2006，25（6）：885-894.

[5]? Ratajczak J，Miekus K，Kucia M，et al. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors：EVsidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery [J]. Leukemia，2006，20（5）：847-856.

[6]? Valadi H，Ekstrom K，Bossios A，et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells [J]. Nat Cell Biology，2007，9（6）：654-659.

[7]? Pegtel DM，Cosmopoulos K，Thorley DA，et al. Functional delivery of viral miRNAs via exosomes [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（14）：6328-6333.

[8]? Thomou T，Mori MA，Dreyfuss JM，et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues [J]. Nature，2017，542（7642）：450-455.

[9]? Sansone P，Savini C，Kurelac I，et al. Packaging and transfer of mitochondrial DNA via exosomes regulate escape from dormancy in hormonal therapy-resistant breast cancer [J]. Cell Reports，2017，114（43）：E9066-E9075.

[10]? Takahashi A，Okada R，Nagao K，et al. Exosomes maintain cellular homeostasis by excreting harmful DNA from cells [J]. Nat Commun，2017，8：15 287.

[11]? Takasugi M，Okada R，Takahashi A，et al. Small extracellular vesicles secreted from senescent cells promote cancer cell proliferation through EphA2 [J]. Nat Commun，2017，8：15 729.

[12]? Imjeti NS， Menck K，Egea-Jimenez AL，et al. Syntenin mediates SRC function in exosomal cell-to-cell communication [J]. Nat Commun，2017，114（47）：12 495-12 500.

[13]? Wei Y， Wang D， Jin F，et al. Pyruvate kinase type M2 promotes tumour cell exosome release via phosphorylating synaptosome-associated protein [J]. Nat Commun，2017，8：140-141.

[14]? Li L，Li C，Wang S，et al. Exosomes derived from hypoxic oral squamous cell carcinoma cells deliver miR-21 to normoxic cells to elicit a prometastatic phenotype [J]. Cancer Res，2016，76（7）：1770-1780.

[15]? Imjeti S，Menck K，Jimenez A，et al. Syntenin mediates SRC function in exosomal cell-to-cell communication [J]. Cancer Res，2017，114（47）：12 495-12 500.

[16]? Nabet BY，Qiu Y，Shabason JE，et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer [J]. Cell，2017，170（2）：352-366.

[17]? Webber J，Spary L，Sanders A，et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes [J]. Oncogene，2015，34（3）：290-302.

[18]? Baglio S，Lagerweij T，Pérez-Lanzón M，et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression Clinical [J]. Cancer Res，2017，23（14）：3721-3733.

[19]? Feng Q，Zhang C，Lum D，et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis [J]. Nat Commun，2017，8：14 450.

[20]? Godlewski J，Ferrer-Luna R，Rooj AK，et al. Mine MicroRNA signatures and molecular subtypes of glioblastoma：the role of extracellular transfer Stem [J]. Stem Cell Reports，2017，8（6）：1497-1505.

[21]? Zhang L，Zhang S，Yao J，et al. Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth [J]. Nature，2015，527（7576）：100-104.

[22]? Godlewski J，Ferrer-Luna R，Rooj AK，et al. Mine MicroRNA signatures and molecular subtypes of glioblastoma：the role of extracellular transfer [J]. Stem Cell Reports，2017，8（6）：1497-1505.

[23]? Melo S，Sugimoto H，O′Connell JT，et al. Cancer exosomes perform cell-independent microRNA biogenesis and promote tumorigenesis [J]. Cancer Cell，2014，26（5）：707-721.