果糖基轉移酶及低聚果糖生產(chǎn)研究進展

王永波

合成果糖低果糖的酶稱為果糖基轉移酶，也有人認為合成果糖低果糖的酶是水解酶，故又稱-呋喃糖苷酶。它是一種具有可轉移活性和廣泛受體活性的水解酶。以蔗糖和乳糖為原料合成果糖、乳糖等低聚糖，對人體健康有益。因此，果糖基轉移酶和低果糖的生產(chǎn)越來越受到人們的重視。

果糖基轉移酶的來源、性質以及果糖基轉移酶和低果糖的生產(chǎn)同工酶和低果糖生產(chǎn)中存在問題。

果糖基轉移酶和低聚果糖生產(chǎn)中存在問題

果糖基轉移酶合成低聚果糖遇到一個突出問題是該酶活性受到反應副產(chǎn)物葡萄糖抑制，絕大多數(shù)商品低聚果糖含有大量蔗糖和葡萄糖，是一種含多種糖的混合物。在反應體系中加入葡萄糖異構酶或葡萄糖氧化酶以降低葡萄糖含量，可提高低聚果糖產(chǎn)量，并以葡萄糖氧化酶效果較好。在果糖基轉移酶和葡萄糖氧化酶復合體系中，低聚果糖產(chǎn)量最高達98%；但在果糖基轉移酶和葡萄糖異構酶復合酶體系中，葡萄糖異構酶主要動力學參數(shù)發(fā)生變化，以致不能有效降低體系中葡萄糖含量。此外，其它方法，如利用離子交換柱進行色譜分離以提高純度嘗試在生產(chǎn)上均難以奏效。出于生產(chǎn)高純度低聚果糖考慮，可另辟途徑，以富含多聚果糖植物材料為原料、利用微生物產(chǎn)多聚果糖降解酶―菊粉內切酶（EC3.2.1.7）―水解菊粉生產(chǎn)低聚果糖。與由蔗糖經(jīng)果糖基轉移酶作用合成工藝相比，由菊粉內切酶水解菊芋生產(chǎn)低聚果糖優(yōu)勢明顯。至今，國內外還沒實現(xiàn)內切菊粉酶產(chǎn)業(yè)化；但這方面成果及其思路已顯示，其比果糖基轉移酶酶法合成低聚果糖技術具有更重要意義和現(xiàn)實價值，是更先進低聚果糖生產(chǎn)替代技術。

低聚果糖生產(chǎn)

果糖基轉移酶催化生成低聚果糖，分子間果糖轉移反應分兩步進行。第一步生成果糖基―酶復合體，釋放出葡萄糖；第二步再由此復合物將果糖基轉移給水或蔗糖，生成果糖或三糖。在生成反應中蔗糖作為供給體和接受體，在果糖轉移酶或呋喃果糖苷酶作用下分解成果糖基或葡萄糖，果糖基水解成果糖，產(chǎn)物為蔗果三糖，蔗果四糖和蔗果五糖混合物。在低聚果糖生物生成反應中，在生成低聚果糖同時也生成一些葡萄糖副產(chǎn)物，由于副產(chǎn)物生成，阻礙蔗糖轉化，使產(chǎn)物中含有大量葡萄糖或蔗糖，可用葡萄糖氧化酶將葡萄糖氧化成葡萄糖酸或用葡萄糖異構酶轉化葡萄糖為果糖，通過對蔗糖轉移反應協(xié)同效應以達到生成低聚果糖目的。低聚果糖工業(yè)生產(chǎn)是利用微生物產(chǎn)生具有轉果糖基活力的酶，以高濃度蔗糖作底物轉化而來，植物來源酶并不多見。1950年就已發(fā)現(xiàn)果糖轉移酶，但直至上世紀80年代，這種酶才被科學家關注并用于低聚果糖生產(chǎn)。目前工業(yè)上主要通過兩種途徑生產(chǎn)低聚果糖，一種是菊糖水解法，菊粉果糖基轉移酶主要是通過菊粉分子內轉果糖作用從菊粉果糖一端釋放出二果糖酐，反應可持續(xù)進行直至菊粉完全水解為蔗果三糖、蔗果四糖和果糖基蔗果四糖和蔗糖；一種節(jié)桿菌菊粉果糖基轉移酶既能催化菊粉水解形成DFA–III（二–D–呋喃果糖–1，2∶2，3二酐）、蔗果三糖和蔗果四糖，又能水解蔗果三糖和蔗果四糖形成DFA–III。另一種是利用微生物產(chǎn)生果糖基轉移酶轉化合成低聚果糖，低聚果糖利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)β–呋喃果糖苷酶或β–果糖基轉移酶作用于蔗糖，進行分子間果糖及轉移反應進行生產(chǎn)。在發(fā)酵過程中，生產(chǎn)低聚糖有雙重作用，一方面，當以蔗糖與果糖和葡萄糖混合物作為底物時，產(chǎn)物中葡萄糖積累到一定濃度，溶液中游離果糖就會逐漸消失，而果糖是抑制低聚糖合成物質，因而低聚糖合成得到促進；另一方面，被合成聚糖又起到儲備葡萄糖作用，當自由葡萄糖消耗完后，以這種形式儲備葡萄糖就可得到利用。但與黑曲霉產(chǎn)生低聚果糖所不同的是，其主要成分是蔗果三糖。菊粉果糖基轉移酶將三糖分子末端果糖轉移到蔗糖上形成果糖供體分子，以菊粉為底物轉移合成不同的二果糖酐和部分低聚果糖；菊粉內切酶可水解菊粉形成低聚果糖。研究表明，節(jié)桿菌10137產(chǎn)β–呋喃果糖苷酶最佳條件為：溫度30℃，pH 7.5，接種體積分數(shù)為2%，裝液體積40 ml。該條件下β–呋喃果糖苷酶轉移酶活為177.78 U/ mL，酶作用最適pH值6.5，最適溫度30℃，在pH值為6.0- 8.0和45℃以下穩(wěn)定。在以蔗糖和乳糖為原料條件下，將蔗糖水解產(chǎn)生果糖基轉移至乳糖還原性末端C1位羥基上。

總之，通過底物性質，選擇合適果糖基轉移酶，將催化水解反應β–呋喃果糖苷酶除去，用純β–果糖基轉移酶對提高轉化率和進一步研究高濃度低聚果糖生產(chǎn)都具有重要意義。