基于高通量測序的宋河濃香型白酒不同窖齡窖泥細菌群落結構分析

王春艷，宋建陽，呂慧鑫，張玉梅，范玉璞，李學思，郭書賢*

（1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004；2.河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；3.河南省宋河酒業股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

白酒釀造過程實質上是多種微生物繁殖和代謝的過程，中國傳統的濃香型白酒以固態發酵為特征，糖化、酒化、酯化等多種生化反應均在窖池中完成。窖泥是微生物的載體，其復雜的微生物菌群不斷進行自然選擇與淘汰，最終形成特有的微生態環境。窖泥微生物產生的廣譜代謝產物，對濃香型白酒復合香氣的形成起著至關重要的作用，窖泥微生物種類和數量，在一定程度上決定了濃香型白酒的質量[1]。窖泥微生物群落結構及其變化規律的研究，能夠為實現從白酒釀造“源頭”—微生物菌群改造來提高白酒品質提供理論和技術支撐。

傳統研究窖泥微生物常采用菌種分離培養技術，該方法僅能對極少數可培養微生物進行分析，難以客觀揭示窖泥微生物的多樣性。磷酸脂肪酸（phosphor lipid fatty acid，PLFA）生物標記、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）、TA克隆文庫、單鏈構象多態性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等現代分子生物學免培養技術一定程度上克服了傳統純培養技術的弊端，但仍存在工作量大、成本高，僅對群落中主要成分比較敏感等缺陷[2-4]。與上述方法相比，高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術對微生物群落結構的研究有著明顯的先進性和優勢，具有成本低、通量高、覆蓋廣泛、耗時短等特點。其結合生物信息學分析，能更加科學、準確地表征或預測微生物的群落結構，樣本間差異性比較更具說服力[5]。

目前，利用高通量測序技術已經對五糧液、瀘州老窖、古井貢酒、中周羌稞養生酒以及古襄陽酒等酒業窖池中窖泥的微生物群落進行了不同程度的解析[2，6-9]。河南是中華酒的發源地，豫酒在經歷了10年漫長的低谷期后，2017年，省委省政府將豫酒振興列為全省產業轉型升級攻堅工作之一。振興豫酒品質先行，白酒品質是發展根基，窖泥是濃香型白酒生產的關鍵，但是針對河南省濃香型白酒窖泥的研究非常薄弱。宋河酒業是濃香型豫酒代表，但目前對其窖泥微生物的研究還限于傳統純培養技術以及局部窖泥的微生物變化規律探討[10-11]。因此，本研究以宋河濃香型白酒不同窖齡窖泥為研究對象，采用高通量測序技術對不同窖齡的窖泥、同一窖池不同部位窖泥細菌群落結構進行全面分析，同時對窖泥細菌群落結構與窖泥理化指標的相關性進行典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA），探討影響其群落結構的環境因素，為最終實現微生物菌群改造提升白酒品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

6年窖齡的窖壁泥（W1）和窖底泥（W2）、16年窖齡的窖壁泥（Y1）和窖底泥（Y2）樣品均采自河南宋河酒業股份有限責任公司白酒生產窖池。采用五點取樣法采集窖底泥（四角及窖底中心），距窖口約50 cm處采集窖壁泥（四壁中心），樣品充分混勻后迅速裝入無菌采樣袋，低溫帶回實驗室，-20℃保存備用。

1.1.2 主要試劑

E.Z.N.A.Soil脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMEGA公司；TaqDNA聚合酶（5U/μL）：寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：西班牙Biowest Agarose公司；MagicPure磁珠核酸純化試劑盒：北京全式金生物技術有限公司；引物341F和805R：生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設備

HQd水質分析儀：美國HACH公司；IlluminaMiseqPE250高通量測序儀：美國Illumina公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIORAD公司；Qubit3.0熒光定量儀：美國Thermo Fisher公司；GelDoc-ItTS3凝膠成像系統：美國UVP公司；FE28/S210K pH計：瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥理化特性分析

對窖泥樣品的理化指標（水分、有機物含量、有效磷含量、pH值以及氨基酸態氮含量）進行測定。水分的測定：新鮮窖泥于105℃烘干2 h，測定烘干前后質量差，計算得到樣本水分。有機物含量的測定：采用重鉻酸鉀容量法[12]。有效磷含量的測定：采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法[13]進行測定。pH值的測定：采用電位法進行測定[14]。氨基酸態氮含量的測定：取1.0 g窖泥樣品于50 mL 0.1 mol/L KCl中，振蕩浸提30 min，過濾，采用靛酚蘭比色法測定[15]。

1.3.2 窖泥總DNA的提取

采用E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒提取窖泥樣品中微生物的基因組DNA，于-20℃保存。

1.3.3 PCR擴增及Illumina MiSeq測序

以基因組DNA為模板，采用引物341F和805R對細菌16S rDNA的V3～V4區進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Taq master Mix 15 μL，DNA模板10 ng，10 μmol/L正反向引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）補充至30 μL。PCR擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸30 s，共5個循環；然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共20個循環；最后72℃延伸5 min。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖電泳檢測后，采用MagicPure磁珠核酸純化試劑盒對PCR擴增產物進行純化、回收，利用Qubit3.0DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，所有DNA樣本等量混合后，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.4 高通量測序數據分析

采用Usearch軟件剔除測序結果中的嵌合序列，以97%序列相似性標準劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），調用Mothur軟件，計算各個樣品覆蓋率（Coverage）和辛普森（Simpson）指數、香農（Shannon）指數等多樣性指數及ACE、Chao1豐富度指數。

1.3.5 典范對應分析

利用Canoco Windows 4.5軟件對窖泥細菌群落特性與環境因子的相關性進行典范對應分析。WCanoImp軟件將OTUs與環境因子數據轉換為Canoco識別格式，經Canoco Windows 4.5軟件運算后利用Canodraw for Windows作圖。

2 結果與分析

2.1 窖泥理化指標分析

窖泥的理化指標檢測結果見表1。由表1可知，隨著窖齡的增加，窖泥的pH值、水分、氨基酸態氮、有效磷以及有機物含量均呈現增長的趨勢。窖泥養分的組成是窖泥質量的重要標志，也是微生物生長繁殖的重要基質，其在不同程度上影響窖泥微生物群落的組成、分布及菌群演變。

表1 窖泥樣品的理化指標Table 1 Physicochemical indexes of pit mud samples

2.2高通量測序結果及Alpha多樣性分析

利用Illumina Miseq測序平臺得到窖泥樣品W1、W2、Y1、Y2的原始序列數分別為44 842條、48 003條、48 750條和55 762條。使用Usearch剔除嵌合序列，并與silva數據庫代表性序列進行Blast比對，覆蓋率低于60%，相似度低于70%的序列被認為是靶區域外序列，剔除該部分序列后最終得到的有效序列數分別為40930條、43757條、38595條和50037條，其平均長度分別為427.59 bp、425.68 bp、407.99 bp和417.81 bp。

在97%序列相似性水平上劃分OTU，4個窖泥樣品共得到4 561個OTUs，對其進行Alpha多樣性分析，結果見表2。由表2可知，4個窖泥樣品的覆蓋率均＞98%，表明試驗的取樣合理，測序結果能真實反映樣本的實際情況。窖泥樣品Y2的香農指數（3.51）最高，辛普森指數（0.09）最低，說明其細菌群落的多樣性最高；窖泥樣品W2的ACE指數（2 876.21）及Chao1指數（2 293.38）最高，說明其細菌群落物種的豐富度最大，同時發現無論多樣性還是豐富度，窖泥樣品Y2高于Y1，W2高于W1。由此可見，窖齡越長的窖泥微生物多樣性越高，相同窖齡的窖底泥微生物多樣性及豐富度高于窖壁泥。這與DING X F等[16-17]的研究結果相一致。

表2 窖泥樣品細菌的序列數、OTU數及Alpha多樣性指數Table 2 Sequence number,operational taxonomic unit number and Alpha diversity index of bacteria in pit mud samples

基于窖泥樣品中細菌的香農指數繪制稀釋性曲線，結果見圖1。由圖1可知，4個窖泥樣品的稀釋性曲線趨向平坦，進一步說明本次測序數據量合理[17]。

圖1 基于香農指數不同窖泥樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of different pit mud samples based on Shannon index

2.3 基于屬水平窖泥細菌群落結構分析

依據高通量測序獲得的序列信息，在屬水平上分析窖泥細菌的種類和相對豐度。根據相對豐度將樣本中的菌屬分為優勢菌屬（相對豐度≥1.0%）和次要菌屬（相對豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他（others），結果見圖2。

圖2 基于屬水平窖泥中細菌群落結構分析Fig.2 Analysis of bacterial community structure of pit mud based on genus level

由圖2可知，6年窖池窖泥細菌群落多樣性較低，窖底泥與窖壁泥中細菌群落結構差異性不大，均以厚壁菌門（Firmicutes）的乳酸菌屬（Lactobacillus）為絕對優勢細菌屬，相對豐度分別為96.09%和78.35%。16年窖池窖泥細菌群落多樣性愈加豐富，細菌主要歸屬于厚壁菌門（Firmicutes）、互養菌門（Synergistetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）3個門類。16年窖壁泥與窖底泥細菌群落結構在屬水平上差異顯著，窖壁泥與窖底泥共有的絕對優勢細菌屬主要為梭菌屬（Clostridium）、氨基酸桿菌（Aminobacterium）、理研菌屬（Petrimonas）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）和消化鏈球菌屬（Sedimentibacter）。兩者特有絕對優勢細菌屬共7種，其中乳酸菌屬的變化最明顯，16年窖底泥中其相對豐度高達50.66%，為絕對優勢細菌屬，而在窖壁泥中其相對豐度僅為0.35%，為次要細菌屬。與6年窖池窖泥細菌群落結構相比，16年窖池窖泥乳酸菌屬相對豐度顯著降低，梭菌屬和氨基酸桿菌增長迅速，其相對豐度在窖壁泥、窖底泥中分別為49.01%、9.98%和12.84%、20.05%。HUX等[18]應用Illumina Miseq技術對江蘇湯溝濃香型白酒優質、普通和退化窖泥中細菌多樣性進行了分析，研究發現隨著窖泥質量的提升，乳酸菌屬含量顯著減少，而梭菌屬、氨基酸桿菌等核心屬的含量明顯增加；羅雯等[19]借助高通量測序技術探討了四川某知名濃香型白酒生產廠不同性狀窖泥的微生物群落結構組成，研究同樣發現趨老熟、老熟窖泥中梭菌屬優勢較為明顯。結果表明，本研究中的16年窖池已經成為趨于老熟化的優質窖池，利用微生物群落組成預測窖泥質量具有一定可行性。

2.4 典范對應分析

采用Canoco for Windows 4.5軟件對4種窖泥細菌群落結構與理化指標的相關性進行典范對應分析，結果見圖3。由圖3可知，窖泥樣品W1、W2均位于第三象限，說明6年窖底泥、窖壁泥細菌群落結構具有較高相似度。胡曉龍[20]研究發現，優質窖泥處于較高pH值、氨基酸態氮及有效磷環境中，本實驗同樣發現，16年優質窖泥與上述3個理化指標呈現正相關性。且5個理化指標中，pH值與有機物含量分別是影響窖泥樣品Y1、Y2的主要理化指標。因此，根據典范對應分析結果推測，窖池窖泥的pH值和有機物含量可能是導致16年窖池窖泥細菌群落結構發生較大變化的外因。

圖3 窖泥細菌群落與理化指標的典范對應分析Fig.3 Canonical correspondence analysis of bacterial community and physicochemical indexes of pit mud

3 結論

本研究運用Illumina MiSeq高通量測序技術較為全面的分析了河南宋河濃香型白酒不同窖齡窖泥、同一窖池不同部位窖泥的細菌群落結構特征及其影響因素。結果表明，窖齡越長窖泥細菌群落多樣性越高，且相同窖齡、同一窖池的窖壁泥的細菌多樣性小于窖底泥。6年窖壁泥與窖底泥的細菌群落結構相似，絕對優勢細菌屬均為Lactobacillus。16年窖壁泥與窖底泥的細菌群落結構差異較大，共有的絕對優勢細菌屬為Clostridium、Aminobacterium、Petrimonas、Syntrophomonas和Sedimentibacter。特有細菌屬中Lactobacillus相對豐度的降低以及Clostridium和Aminobacterium相對豐度的迅速增長，均表明16年窖池已成為趨于老熟化的優質窖池。CCA分析結果推測，pH值和有機物含量可能是影響16年窖壁泥與窖底泥細菌群落結構不同的主要環境因子。