基于氣相色譜-質譜和液相色譜-質譜技術的冷鮮灘羊肉貯藏中脂肪差異代謝物檢測

苑昱東，尤麗琴，羅瑞明*，劇 檸，趙曉策

（寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

寧夏鹽池灘羊是寧夏優勢特色畜種，其肉脂肪分布均勻，肉質鮮美，風味獨特，廣受消費者歡迎[1-2]。冷鮮灘羊肉是指嚴格執行檢疫制度，對屠宰后的畜胴體迅速進行冷卻處理，使胴體溫度在24 h內降為0～4 ℃，并在后續加工、流通和銷售過程中始終保持0～4 ℃范圍內的生鮮羊肉[3-4]。

隨著人們生活質量的逐步提高，冷鮮肉正替代熱鮮肉成為人們肉類消費中的主流。冷鮮肉保留了肉質絕大部分營養成分，具有鮮嫩多汁、易咀嚼等特點，因此隨著社會經濟發展，肉品產業的發展趨勢將是品質佳的低溫冷鮮肉[5-7]。冷鮮肉貯藏過程中脂肪代謝的變化，是肉成熟理論研究的重要領域。代謝組學技術是對代謝物的集合進行分析，是對代謝物的整體變化規律系統化[8-9]。現在主要的檢測手段有：液相色譜-質譜（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）聯用技術、毛細管電泳-質譜聯用技術以及氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用技術[10-13]。Abraham等[14]采用了GC-MS、LC-MS聯用技術，結合主成分分析及偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA），對牛腰最長肌和腰大肌的代謝物進行了檢測。目前，對于宰后代謝的研究多集中在某個或某幾個代謝物[15-21]，如李永鵬等[22]采用GC-MS技術對比了宰后成熟過程中牦牛肉中揮發性風味化合物的變化情況表明，成熟后的牦牛肉中，含硫化合物（肉香味）比成熟前增加了24%，特別是2-乙酰基噻唑（肉香）、甲硫基丙醛（肉湯味）分別增加了100%和78%。朱榮生等[23]對冷藏期間豬肌肉中肌苷酸沉積規律進行的研究表明，肌苷酸與核糖在水和脂肪中加熱能產生明顯的鮮味，但肌肉中肌苷酸及其降解產物肌苷、次黃嘌呤含量在貯藏過程中呈動態變化。隨貯藏期延長，肌苷酸含量先增加后逐漸降低，肌苷和次黃嘌呤在貯藏第5～6天時達到最高值。而對宰后貯藏過程中脂肪細胞的整個代謝過程報道較少。

脂質在肉類風味發展中起多重要的作用。Toldrá等[24]采用GC-MS檢測了豬肉中糖及其相關物質的代謝情況，結果表明糖酵解，蛋白質水解和脂肪分解產生大量化合物如糖、肽、氨基酸、無機鹽和有機酸等，以上化合物對肉類風味起很重要的作用，并且大多數內源性酶是引起這種反應的主要原因。文志勇等[25]研究了脂質氧化所產生的香味物質。表明，油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸氧化生成揮發性醛如己醛、庚醛等，而油酸、亞油酸等脂肪酸被認為是產生風味物質的前體。本實驗以灘羊宰后脂肪細胞為特殊生命系統，采用GC-MS、LC-MS技術研究宰后脂肪細胞0～4 ℃貯藏中可檢測出的全部代謝物、代謝通路，及其厭氧呼吸條件下的相互關系及聯動轉化，分析時間推移中代謝網絡變化。通過代謝組學研究宰后脂肪組織代謝物與風味物質前體、中間體的關聯，進一步研究灘羊肉風味物質前體、中間體合成途徑及其調控機制，為冷鮮灘羊肉生產技術改進提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

所取樣本均來自現宰殺的鹽池灘羊 寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜、色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）美國Waters公司；AB Triple TOF 5600高分辨質譜美國應用生物系統公司；Pegasus 4D全二維氣相色譜飛行時間質譜聯用儀 美國Leco公司；色譜柱DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm，J&W Scientific，Folsom，CA）。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集貯藏溫度為0～4 ℃，相對濕度為85%的灘羊背最長肌上部皮下脂肪400 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為4 d，即采樣時間點為第0、4、8、12天，每組樣本做8 個平行。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 GC-MS樣品前處理

精密稱取30 mg/組樣本，放入1.5 mL的離心（EP）管中。依次加入兩顆小鋼珠，加入20 μL的內標（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配制）和600 μL預冷的甲醇-水溶液（4∶1，V/V），在-80 ℃冰箱中放置2 min。隨即放入研磨機中研磨（60 Hz，2 min），加入120 μL氯仿。再用冰水浴超聲提取10 min，4 ℃靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取300 μL的上清液裝入玻璃衍生瓶中。質控樣本（quality control，QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC的體積與樣本相同。采用冷凍濃縮離心干燥器揮干樣本。隨后向玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液（15 mg/mL），渦旋振蕩2 min后，于振蕩培養箱中37 ℃中90 min進行肟化反應。將樣本取出后再加入80 μL的（bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide，BSTFA，含1%TMCS）衍生試劑和20 μL的正己烷，渦旋振蕩2 min后，于70 ℃反應60 min。取出樣本后，在室溫放置30 min，進行GC-MS代謝組學分析。

1.3.2.2 LC-MS樣品前處理

精確稱取30 mg/組樣本于1.5 mL EP管中，加入20 μL內標（L-2-氯-苯丙氨酸0.3 mg/mL，甲醇配制），加入400 μL甲醇-水溶液（4∶1，V/V）；加入兩個小鋼珠，在-80 ℃冰箱中放置2 min后，放入研磨機中研磨（60 Hz、2 min）；冰水浴中超聲提取10 min；-20 ℃靜置30 min；4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用注射器吸取150 μL的上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到LC進樣小瓶，-80 ℃保存，直到進行LC-MS分析。QC由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC的體積與樣本相同。

1.3.3 儀器測定條件

1.3.3.1 GC-MS條件

色譜條件：DB-5MS毛細管柱（30 m × 250 μm），載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），流速1.0 mL/min，進樣口的溫度260 ℃。進樣量1 μL，不分流進樣。程序升溫：柱溫箱的初始溫度為80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min程序升溫至180 ℃ ，5 ℃/min升溫至240 ℃；20 ℃/min升溫至280 ℃保持9 min。

質譜條件：電子電離源，離子源溫度220 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式，質量掃描m/z30～600。

1.3.3.2 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫45 ℃；流動相：水（含0.1%甲酸）、乙腈（含0.1%甲酸）；流速0.4 mL/min；進樣體積5 μL。

質譜條件：電噴霧；樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。

1.4 數據處理

將所得的數據導入SIMCA軟件包（version 14.0，Umetrics，Ume?，Sweden），先采用無監督的主成分分析（principal component analysis，PCA）觀察各樣本之間的總體分布和整個分析過程的穩定性，后用有監督的PLS-DA區分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。為防止模型過擬合，采用7 次循環交互驗證和200 次響應排序檢驗的方法考察模型的質量。

1.4.1 GC-MS數據預處理

將采用GC-MS所得數據導入Chroma TOF（version 4.34，LECO，St Joseph，MI）軟件進行預處理，峰提取、去噪音、反卷積等；而后采用內標法對數據進行歸一化處理，經過濾后，檢測到物質峰578 個，使用NIST和Fiehn數據庫對代謝物進行定性，導出原始數據矩陣。

1.4.2 LC-MS數據預處理

對所有樣本的基峰色譜圖進行可視化檢查，將原始數據轉換為mzML格式，峰提取后，將內標峰從矩陣中刪除。再進行歸一化處理。將QC中相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）大于30%的變量刪除。圖1a、b分別展示了質控樣本正負離子模式下的總離子流圖。

圖1 QC樣本的總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of QC samples

將正負離子數據合并成一個數據矩陣，該矩陣包含了原始數據提取到的所有可以用于分析的信息。從表1可以看出，對QC以RSD低于30%進行篩選，特征值得率大于75%，說明該代謝組學方法具有的良好重復性。

表1 QC樣本篩選結果（RSD＜30%）Table 1 Filtering of QC samples for RSD ＜ 30%

2 結果與分析

2.1 多元變量分析

2.1.1 基于GC-MS對灘羊脂肪冷鮮貯藏不同組別的多元變量分析

圖2 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PCA得分圖Fig. 2 Score plots of PCA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

應用PCA法分別對冷鮮灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的代謝物進行GC-MS檢測數據分析。PCA得分圖如圖2所示。

為了將上述組別更好地區分，又采用PLS-DA法將樣本歸類分析。在PLS-DA中，一般變量權重值（variable important in projection，VIP）大于1的變量被認為是差異變量，結果見圖3。

圖3 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PLS-DA得分圖Fig. 3 Score plots of PLS-DA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat sotred for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days,and 8 versus 12 days

由圖3可見，灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組均可完全區分；但各組內呈現一定發散分布，這反映了灘羊脂肪貯藏4 d組、8 d組及12 d組組內存在明顯差異。該模型的可解釋變量R2X=0.512，模型可預測度Q2=0.092 2。表明該模型能很好地解釋和預測兩組樣本之間的差異。采用隨機多次的排列實驗進一步檢驗實驗的有效性，以分類變量y的不同排列順序所對應不同的隨機Q2值作為檢驗模型穩健性的評判標準。響應排序檢驗圖如圖4所示。

圖4 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的響應排序檢驗圖Fig. 4 Permutation test of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

由圖4可得，灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的響應排序檢驗截距分別為R2=0.774，Q2=-0.379、R2=0.789，Q2=-0.335及R2=0.811，Q2=-0.327體現了模型的穩健性，表明基于GC-MS技術建立的PLS-DA模型能較好的解釋各組之間的差異。

2.1.2 基于LC-MS對灘羊脂肪冷鮮貯藏不同組別的多元變量分析

應用PCA法分別對冷鮮灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的代謝物進行LC-MS檢測數據分析。PCA得分圖如圖5所示。

圖5 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PCA得分圖Fig. 5 Score plots of PCA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

為了將上述組別更好地區分，找到潛在的差異代謝物，又采用了PLS-DA法將樣本歸類分析，結果見圖6。

圖6 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的PLS-DA得分圖Fig. 6 Score plots of PLS-DA model obtained for differential metabolites of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

由圖6可見，灘羊脂肪貯藏0 d組與4 d組、4 d組與8 d組、8 d組與12 d組均可完全區分；其各組內呈現一定的分散分布，說明各組內存在明顯的差異。該模型的可解釋變量R2X=0.531，模型可預測度Q2=0.089 3。表明該模型能很好地解釋和預測兩組樣本之間的差異。采用隨機多次的排列實驗進一步檢驗實驗的有效性，以分類變量y的不同排列順序所對應不同的隨機Q2值作為檢驗模型穩健性的評判標準。響應排序檢驗圖如圖7所示。

圖7 冷鮮灘羊脂肪貯藏不同組別的響應排序檢驗圖Fig. 7 Permutation test of Tan sheep meat lipids stored for 0 versus 4 days, 4 versus 8 days, and 8 versus 12 days

由圖7可得，灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的響應排序檢驗截距分別為R2=0.612，Q2=-0.707、R2=0.654，Q2=-0.798及R2=0.467，Q2=-0.426體現了模型的穩健性，表明基于LC-MS技術建立的PLS-DA模型能較好的解釋各組之間的差異。

2.2 差異代謝物篩選

采用多維分析和單維分析相結合的方法，篩選組間差異代謝物，標準為PLS-DA模型第1主成分的VIP值高于1.2，t檢驗的P值低于0.05。

采用GC-MS技術篩選出冷鮮灘羊脂肪貯藏0 d組和4 d組、4 d組和8 d組、8 d組和12 d組的差異代謝物分別為64、65、27 種。采用LC-MS技術篩選出各組的差異代謝物分別為99、75、70 種。從差異代謝物種類變化可知，所獲得的差異代謝物的種類隨冷鮮灘羊脂肪貯藏時間的延長呈先升后降趨勢。

2.3 差異代謝物的種類及變化分析

采用GC-MS篩選出的飽和脂肪酸有花生酸、硬脂酸、棕櫚酸；n-6不飽和脂肪酸有亞油酸、花生四烯酸；n-9不飽和脂肪酸有油酸、反油酸。采用LC-MS篩選出的飽和脂肪酸有硬脂酸；n-3不飽和脂肪酸有二十碳五烯酸。

將篩選出的差異代謝物中與糖酵解及脂質代謝的相關差異代謝物，做關聯對比分析。在0 d組與4 d組中發現糖酵解原料葡萄糖、果糖相對含量顯著上升相，說明宰后冷鮮貯藏4 d內，與葡萄糖、果糖相關的正常代謝途徑受阻，導致二者含量積累。在此時，丙酮酸的相對含量下降，說明糖酵解生成丙酮酸的途徑受阻或相關代謝通路關閉，而丙酮酸與生糖氨基酸的相互轉化及進入三羧酸循環的相關代謝途徑并未受到抑制，故丙酮酸的相對含量顯著下降。在4 d組與8 d組中發現糖酵解的產物葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸的相對含量顯著上升，該現象說明經過一段冷鮮貯藏后，葡萄糖、果糖轉化為葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸的相關合成途徑打開，這可能是由于與該途徑相關的酶的活性提高[26-32]。

所篩選出的游離氨基酸在冷鮮貯藏第8天時相對含量發生變化，在之后的貯藏期內無變化；如蘇氨酸、丙氨酸、D-絲氨酸、DL-正亮氨酸在貯藏第8天時相對含量顯著上升，而天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸相對含量顯著下降。這說明大部分游離氨基酸在貯藏第8天時產生，而其中蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酸及天冬氨酸、精氨酸等屬呈味氨基酸[33-34]。同時還發現了呈苦味物質次黃嘌呤[35-41]，其由肌苷轉化而來[42-43]。說明了在冷鮮貯藏第8天時，呈味小分子物質含量出現較大變化。

在貯藏第8天時，由GC-MS檢測到油酸、硬脂酸、棕櫚酸含量顯著下降。結合LC-MS中檢測到的L-肉堿代謝的變化，可知在第8天時肉堿相對含量增高，而丙酮酸的相對含量上升，這與油酸、硬脂酸、棕櫚酸的相對含量下降相對應，說明在貯藏第8天時，脂肪酸的代謝較活躍，可能是與肉堿參線粒體中乙酰輔酶A的合成從而進一步使脂肪酸代謝活躍[27]。具體差異代謝物如表2、3所示。

13-羥基十八碳二烯酸（13-hydroxyoctadecadienoicacid，13-HODE）作為亞油酸的分解產物，其在貯藏4 d時的平均表達量顯著升高，這種現象可能由于13-HODE的主要代謝方式是通過NAD+依賴性脫氫酶（13-HODE脫氫酶）氧化成2,4-二烯酮、13-HODE的過程受阻或亞油酸分解活躍所導致的。13-HODE是由亞油酸在動物體內合成的[44-45]。大多數與脂肪酸相關差異代謝物的相對含量變化均發生在4～8 d內，如油酸、棕櫚酸、硬脂酸及二十碳五烯酸，而油酸、棕櫚酸、硬脂酸在4 d與8 d組中相對含量均下降，而二十碳五烯酸相對含量上升。該現象說明，在貯藏期第8天時，與脂肪酸相關的代謝途徑受到抑制，雖然第4天時并沒有檢測到相關脂肪酸相對含量的變化，亦可能是由于此類代謝物在4 d時并無表達量差異所致。

所篩選出的游離脂肪酸在冷鮮貯藏第8天時相對含量發生顯著變化，該現象的原因可以解釋為脂質氧化降解所產生的香氣物質如有烤肉味的反,反-2,4-癸二烯醛，具有油脂味的壬醛及有肥皂味的2-庚酮，有青草味的1-己醇等的前體物質為棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸、油酸及其組合[46-51]。這也進一步證明在冷鮮貯藏過程中，風味物質的前體就已經產生。

表2 采用GC-MS篩選的冷鮮灘羊脂肪貯藏12 d主要差異代謝物種類及平均表達量變化Table 2 Changes in average expression levels of main differential metabolites in chilled Tan sheep meat lipids during 12-day storage determined by GC-MS

3 結 論

冷鮮灘羊脂肪貯藏過程中差異代謝物的種類隨貯藏時間的延長總體呈下降趨勢。宰后機體內很快處于缺氧狀態，但細胞仍企圖維持其ATP在一個較高水平，機體利用糖酵解代替氧化磷酸化而提供ATP以及利用磷酸肌酸和ADP的轉化補充ATP，于是構成了一個宰后供能反應體系。0 d組與4 d組，與糖代謝有關的物質如葡萄糖，含量上升，說明這段時間內，細胞處于無氧環境中，在0～4 ℃的溫度下，并沒有立即進行糖酵解過程。4 d組與8 d組，細胞在低溫環境下，利用氨基酸、糖等能源物質供能，同時，脂肪代謝的途徑也被激活，在此時大量的呈味物質產生，如呈苦味及鮮味的次黃嘌呤、丙氨酸及蘇氨酸，以及脂肪代謝產生的種風味物質前體的油酸、棕櫚酸、硬脂酸。脂肪細胞中檢測出次黃嘌呤、丙氨酸及蘇氨酸等呈味物質的現象可以解釋為，氨基酸、糖、脂肪酸之間的轉化體系在屠宰時突然停止，雖然機體死亡，但組織、細胞的代謝活動并未停止，只是在機體死亡后，正常的三者之間的轉換途徑突然關閉，而經過一段時間的冷鮮貯藏后，其相互轉換的途徑重新開啟所致。貯藏8 d作為宰后細胞代謝活動的分水嶺，風味物質前體如油酸、棕櫚酸、硬脂酸在此時段內產生，但其含量在8 d后就處于下降狀態。而采用GC-MS和LC-MS法檢測全部代謝產物，更深入的了解了宰后代謝的整體變化情況，結果表明，兩種方法下測出的差異代謝物有互補作用。因此，研究宰后脂肪代謝隨貯藏時間的推移變化，能為冷鮮灘羊肉生產技術改進提供理論指導。