一種純化培養腐爛莖線蟲的方法

毛佳 曹凱歌 章安康 汪國蓮 孫厚俊 王宏寶

摘 要：腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）系世界上一種重要的植物病原線蟲。試驗通過甘薯培養皿接種法、薯條離心管接種法、薯塊切片打孔接種法等3種方法比較線蟲培養方面的優缺點，篩選出以甘薯切片打孔接種法，接種已受孕單條雌蟲為接種對象的培養體系。該體系為高純度培養純化腐爛莖線蟲提供新思路，同時也為系統研究腐爛莖線蟲個體遺傳學及個體發育學等學科提供技術參考。

關鍵詞：腐爛莖線蟲;純化培養;甘薯

中圖分類號 S432文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）16-0080-03

Abstract：Ditylenchus destructor is an important plant pathogenic nematode in the world. In this experiment，the advantages and disadvantages of nematode culture were compared by three methods： sweet potato culture dish inoculation method，potato centrifugal tube inoculation method and potato slice drilling inoculation method. A culture system was screened，in which sweet potato slice drilling inoculation method was used to inoculate a single pregnant female. This system provided a new idea for high purity culture and purification of rotten stem nematode，and also provided a systematic study of rotten stem nematode. Individual genetics and ontogeny provide technical references.

Key words：Ditylenchus Destructor;Purification training;Sweet potato

甘薯腐爛莖線蟲病是我國農業上的重要病害，在國內主要分布于河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇等省區。其病原物甘薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）最早在馬鈴薯上發現，導致馬鈴薯腐爛[1]。

甘薯莖線蟲病是我國甘薯產區的重要病害之一，其病原腐爛莖線蟲是我國重要的檢疫性對象。近年來由于甘薯生產上引種不當，造成甘薯莖線蟲病的大面積蔓延，該病害是由線蟲危害引起的，病原經南京農業大學丁再福等[2]鑒定是馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor），這是植物寄生線蟲中唯一引起植物干腐癥狀的病原物，甘薯受到馬鈴薯腐爛莖線蟲的侵染，輕者減產10%～30%，重者達50%～80%，甚至絕收[3]。該線蟲除了危害馬鈴薯、甘薯，還危害胡蘿卜、花生、薄荷等。

通過簡單和易操作的方法獲得群體純度高、生命力良好的線蟲是系統研究該線蟲的生物學特性、致病機理、種群群體及個體的遺傳變異等工作的基礎和前提。目前系統進行純化培養該線蟲的方法，一般通過下述幾種渠道獲得。如在PDA平板中接入茄腐鐮刀菌，灰葡萄孢和毛殼菌，25℃溫箱中暗培養腐爛莖線蟲，另外，劉斌等人報道采用玉米培養基培養的灰葡萄孢對腐爛莖線蟲進行單異活體培養，在室內可以快速大量繁殖腐爛莖線蟲，阮龍等人報道采用甘薯發根單寄主培養體系繁殖腐爛莖線蟲的方法，上述純化培養方法都是通過接種大量線蟲獲得成功，且純化成功的基礎是在大量接種前進行腐生線蟲等其它蟲體的去除，因此，建立1種快速、高效培養腐爛莖線蟲的方法是本研究的重點。

1 材料與方法

1.1 線蟲種群 供試腐爛莖線蟲群體來自河南洛陽的DeYL群體。所用薯塊品種為蘇渝303。

1.2 線蟲的準備 在40×體式顯微鏡下用線蟲針挑取線蟲種群雌蟲放在玻片上，并轉到100×顯微鏡下進一步確認無誤后，收集到凹面皿中備用。

1.3 純化培養方法

1.3.1 薯片培養皿接種法 將切好的薯片放在瓊脂糖凝膠平板中用于接種線蟲。平板中的薯片中心位置（事先用滅菌刀切1個小口）分別接種50條，20條，10條，5條、2條線蟲，之后將平板封口后置于25℃培養箱中培養30d后觀察結果[4-5]。

1.3.2 薯條離心管接種法 在離心管里注入20vl無菌水后將線蟲挑入其中，將打孔器打下的薯條用滅菌刀切下約2～3cm部分置于2ml離心管內，培養溫度、時間同1.3.1。

1.3.3 薯塊切片打孔接種法 將整薯縱向切去1/3，留下的部分用打孔器打孔，孔間距約3cm，在接入線蟲之前，先在每個孔里注入少許無菌水，以不溢出小孔為準。將線蟲接到小孔內，將切下的部分薯塊做為天然保濕蓋蓋在處理過的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，皮筋捆綁后平放在培養箱里，在儲藏盒內預先噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環境，以利于線蟲的生長發育。

線蟲自交純化培養方案中，采用上述3種接種方法，將線蟲種群的1條大齡幼蟲和2條雄蟲接入接種點（小孔、皿中心接種點、離心管底部）中自交。將每次處理置于計數皿中分離觀察。單條受孕雌蟲線蟲純化培養法采用線蟲薯塊切片打孔法，即將線蟲種群的1條受孕雌蟲用線蟲針接入打好孔的薯塊中，接入線蟲后用石蠟封口。以上線蟲培養方案均在25℃培養箱中培養30d后觀察統計線蟲繁殖情況[4-5]，每個處理重復20次。

1.4 結果統計與數據處理 對原始數據應用excel和DPS統計軟件處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同接種數量對線蟲繁殖的影響 由表1可知，采用1.1.3法，接種50條，20條，10條，5條線蟲1個月后均能查到有后代產生。接種2條線蟲自交成功率為20%，表明在平板薯片上接種少量線蟲仍可以產生后代。

2.2 不同接種方法對腐爛莖線蟲繁殖的影響 由表2可知，3種接種方法均能成功純化培養腐爛莖線蟲，比較發現，切片打孔接種法比較實用，同時培養產生的后代數量多，自交繁殖數量為137.4，在P0.05達到顯著水平，自交成功率也較高為50%;其它2種方法培養的線蟲后代數量和自交成功率均較低。腐爛莖線蟲不存在孤雌生殖現象，其繁殖后代只能通過有性生殖進行。

甘薯培養皿接種法的的缺點是占用的甘薯材料多，尤其對于一些稀缺的甘薯材料;離心管里薯條接種法優點是靈巧、方便可以進行大量接種，需要薯塊材料少，便于線蟲集中在一起，增加線蟲自交的幾率，缺點是在培養后期，薯塊體積小、薯皮表面積少，加快薯條水分的損失，再加上線蟲自身對其造成的傷害會使薯條加速老化腐爛，進而影響線蟲生存。而甘薯切片打孔接種法以繁殖數量大，自交成功率高，所用甘薯材料保存完整，微環境更接近原始生存環境為優點，經篩選確定甘薯切片打孔接種法為優化培養腐爛莖線蟲的載體。

2.3 一種純化培養腐爛莖線蟲體系的優化 由表3可知，單雌純化培養與該線蟲自交相比，純化繁殖成功的概率顯著增高，達65%，培養30d后分離觀察后代平均數量為84.15，比親本自交平均繁殖后代數137.4 在P0.05水平上顯著降低，分析認為可能在單條雌蟲接種之前部分卵塊已經排出體外所致。研究也發現2種方法所分離到的線蟲群體整齊度相對均一，但采用單雌純化繁殖所需工作量相對較少，約為2h;而采用線蟲親本自交的工作量相對較大，約為4h;因此，從簡便高效，容易快速純化獲得后代的角度出發，采用甘薯切片打孔法接種受孕單條雌蟲作為純化培養腐爛莖線蟲群體的方法。

3 討論

目前，有關學者對腐爛莖線蟲純化培養研究的并不多，純化培養馬鈴薯莖線蟲的方法大多在真菌上繁殖[6]。腐爛莖線蟲是1種雜食性線蟲，既可以在許多寄主植物的根、塊根和塊莖上寄生危害，也有食菌的特性。據報道，在無高等植物的情況下，該線蟲能夠在大約40個屬70種真菌上繁殖[7-8]。劉斌等人報道通過用玉米培養基培養的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），對腐爛莖線蟲進行的單異活體培養，在室內可以快速、大量繁殖腐爛莖線蟲[6];阮龍等人報道甘薯發根單寄主培養體系繁殖馬鈴薯腐爛線蟲是可行的，且優于胡蘿卜發根繁殖馬鈴薯腐爛線蟲體系。上述繁殖方法對于快速大量繁殖線蟲帶來了便利，但若腐爛莖線蟲在真菌上長時期繁殖培養（寄主發生改變的情況下），可能在致病力等生物學特性方面發生轉變，因此，建立用甘薯（原寄主培養）來進行純化培養線蟲顯得非常重要。

本試驗比較了甘薯培養皿接種法、薯條離心管接種法、薯塊切片打孔接種法的優缺點，篩選出以甘薯切片打孔法接種受孕單條雌蟲來純化培養腐爛莖線蟲群體，為研究腐爛莖線蟲不同種群單雌繁殖力等生物學特性提供技術參考，同時也為研究腐爛莖線蟲群體遺傳學、生物學，個體遺傳學及個體發育學等方向提供重要的技術支持。

參考文獻

[1]Thorne G. Ditylenchus destructor n. sp.，the potato rot nematode，and Ditylenchus dipsaci（Kuhn，1857）Filipjev，1936，the teasel nematode （Nematode：Tylenchidae） [J]. Proc Helm in Soc，1945，12（2）：27-33.

[2]丁再福，林茂松.甘薯、馬鈴薯和薄荷上的莖線蟲的鑒定[J].植物保護學報，1982，9（3）：69-172.

[3]周忠，馬代夫.甘薯莖線蟲病的研究現狀和展望[J].雜糧作物，2003，23（5）：288-290.

[4]林茂松，賀麗敏，文玲.甘薯形態結構對莖線蟲病的抗性機制[J].中國農業科學，1996，29（3）：8-12.

[5]林茂松.室內人工接種測定甘薯品種對馬鈴薯腐爛線蟲的抗性[J].南京農業大學學報，1989，12（3）：44-47.

[6]劉斌，鄭經武.腐爛莖線蟲單異活體繁殖方法研究[J].浙江農業學報，2006，18（6）：445-447.

[7]Faukner L R，Darling H M.Pathological histology，hostsand culture of the potato rot nematode[J]. Phytopathology，1961，5（11）：778-785.

[8]Doncaster C C. Nematode feeding mechanisms. 2. Observations on Ditylenchus destructor and D.myceliophagus feeding on Botrytis cinerea[J]. Nematologica. 1966，12：417-427.

（責編：楊 林）