鋸葉棕漿果油體外抗脂質(zhì)過氧化效果研究

黃秋偉　毛立彥　龍凌云　唐毓瑋　梁惠　黃秋艷

摘 要：以超臨界萃取得到的鋸葉棕果油為研究材料，采用卵磷脂脂質(zhì)過氧化體系研究鋸葉棕果油的抗脂質(zhì)過氧化能力，并對反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，在卵磷脂濃度5 mmol/L、硫酸亞鐵濃度20 mmol/L、水浴時(shí)間15 min的試驗(yàn)條件下，鋸葉棕果油能夠明顯的抑制蛋黃卵磷脂的過氧化進(jìn)程，且低濃度的抑制效果高于高濃度的，當(dāng)果油濃度為1.0 mg/mL時(shí)，過氧化抑制率為73.92 %。為鋸葉棕進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鋸葉棕果油 脂質(zhì)過氧化 抑制作用

Abstract：The fruit oil of saw palmetto extracted by supercritical carbon dioxide was used as study material. The anti-lipid peroxidation ability of saw palmetto fruit oil was studied by using lecithin lipid peroxidation system， and the system was optimized. The test results indicated that saw palmetto fruit oil showed significant inhibition of lipid peroxidation under the experimental conditions of lecithin concentration 5 mmol/L， ferrous sulfate concentration 20 mmol/L and water bath time 15 min. The low concentration of fruit oil performed better than high concentration of fruit oil. The inhibition rate of lipid peroxidation reached 73.92 % when the concentration of fruit oil was 1.0 mg/mL. The results provide a theoretical basis for the further development and utilization of saw palmetto.

Key words：Saw palmetto fruit oil;lipid peroxidation;inhibitory effect

鋸葉棕（Saw palmetto）屬棕櫚科灌木植物，其果實(shí)為核果類的漿果。鋸葉棕果實(shí)中除含有豐富的油酸、亞油酸、亞麻酸等脂肪酸成分外，還含有一些碳水化合物及揮發(fā)性成分[1]。我國缺少野生鋸葉棕資源，只有熱帶的幾個(gè)省份如廣西、廣東、海南等地有關(guān)于鋸葉棕引種適應(yīng)性的調(diào)查報(bào)道[2-4]，因此受限于資源的分布，國內(nèi)關(guān)于鋸葉棕方面的研究較少。當(dāng)前國內(nèi)關(guān)于鋸葉棕的研究，主要關(guān)于果實(shí)提取物治療前列腺肥大癥和抗腫瘤等[5-7]方面的內(nèi)容，且研究材料均是來自國外研制好的成品藥。此外，由于國內(nèi)資源較少，針對于鋸葉棕果實(shí)內(nèi)含物提取的研究也只是有少量的報(bào)道，且提取方式主要是有機(jī)溶劑回流提取和超臨界二氧化碳萃取2種[8-9]，而關(guān)于鋸葉棕果提取物的抗氧化活性研究卻沒有。

抗氧化活性的評價(jià)方法有體外抗氧化和體內(nèi)抗氧化2種，體外抗氧化主要方式就是在生物體外，模擬自由基的生成，通過加入抗氧化劑后，自由基的生成受到抑制或者多余的自由基被清除。生物體內(nèi)過多的自由基引起的氧化作用往往會導(dǎo)致人體疾病如腫瘤、血管硬化和衰老的發(fā)生。脂質(zhì)過氧化就是一個(gè)典型活性氧參與的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。當(dāng)前體外防止脂質(zhì)過氧化模型因不同的氧化底物而分為幾大類，主要研究報(bào)道[10-14]的有磷脂脂蛋白、油酸及亞油酸、小鼠肝臟勻漿、小鼠紅細(xì)胞等4個(gè)脂質(zhì)抗氧化模型。雖然利用這些脂質(zhì)抗氧化體系測定有效成分的抗氧化活性的研究報(bào)道較多，但是這些報(bào)道大多是在現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)中調(diào)整條件參數(shù)后，就開始進(jìn)行試驗(yàn)，而針對于所選用的體系條件的優(yōu)化研究報(bào)道極少，關(guān)于磷脂過氧化體系條件摸索則更少，目前所查到的文獻(xiàn)主要是關(guān)于Fe2+濃度對啟動蛋黃磷脂脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響[15]。本次試驗(yàn)主要是采用磷脂脂蛋白脂質(zhì)抗氧化模型，研究鋸葉棕果油的抗脂質(zhì)過氧化作用，為鋸葉棕進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

鋸葉棕果油：鋸葉棕果實(shí)采摘于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所種質(zhì)資源圃，預(yù)處理之后，并經(jīng)超臨界流體萃取后得到;CO2氣體（食品級，純度≥99.9 %）：廣西國信氣體研究院有限公司;蛋黃卵磷脂（BR級）：上海源葉生物科技有限公司;硫代巴比妥酸（TBA）：上海源葉生物科技有限公司;七水硫酸亞鐵：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸（TCA）：天津市大茂化學(xué)試劑廠;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：廣東光華科技股份有限公司;無水乙醇（AR級）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備

HA221-40型超臨界流體萃取裝置：南通市華安超臨界萃取有限公司;GR200型電子分析天平：日本A&D有限公司; DHG-9109A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;QE-300型中藥材高速粉碎機(jī)：武義屹立工具有限公司;MJ33型快速水分測定儀：梅特勒-托利多公司;HH-S4型數(shù)顯示恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠;3-30K高速冷凍離心機(jī)：德國SIGMA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Fe2+催化蛋黃卵磷脂過氧化反應(yīng)條件的篩選

1.2.1.1 蛋黃卵磷脂濃度的選擇

先用無水乙醇作溶劑，配制10 mmol/L蛋黃卵磷脂溶液作為稀釋母液。依次量取一定量的母液至10 mL容量瓶中并用無水乙醇定容，配成1、2.5、5、7.5、10 mmol/L的卵磷脂濃度液，每個(gè)濃度液各吸取0.2 mL置于5支試管中，然后往5支試管中依次加入無水乙醇溶液0.2 mL、10 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.2 mL，最后加入0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）補(bǔ)至2.0 mL。液體混合均勻后，置于37℃水浴反應(yīng)10 min，反應(yīng)完后取出加20 %TCA溶液1.0 mL，混勻靜置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混勻，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷卻，8000 r/min、4℃條件下離心15 min，取上清液在波長532 nm處測定吸光度。比較不同濃度的蛋黃卵磷脂對吸光值的影響。

1.2.1.2 Fe2+催化劑濃度的選擇

先配制50 mmol/L的硫酸亞鐵母液，依次量取一定量母液至10 mL容量瓶中并加水稀釋定容，配置成5、10、15、20、25 mmol/L的硫酸亞鐵濃度液。取5支試管，往每支試管中先加入2.5 mmol/L卵磷脂溶液0.2 mL、無水乙醇溶液0.2 mL，然后吸取各個(gè)硫酸亞鐵濃度液0.2 mL，最后用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）補(bǔ)齊體積至2.0 mL。液體混合均勻后，置于37℃水浴反應(yīng)10 min，反應(yīng)完后取出加20 %TCA溶液1.0 mL，混勻靜置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混勻，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷卻，8000 r / min、4℃條件下離心 15 ?min，取上清液在波長532 nm處測定吸光度。比較反應(yīng)體系加入不同濃度的硫酸亞鐵對吸光值的影響。

1.2.1.3 水浴反應(yīng)時(shí)間的選擇

取5支試管，每支試管依次加入2.5 mmol/L卵磷脂溶液0.2 mL、無水乙醇溶液0.2 mL 、10 mmol/L硫酸亞鐵溶液0.2 mL，用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）補(bǔ)齊體積至2.0 mL。液體混勻后，置于37℃水浴反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間設(shè)置5、10、15、20、25 min這5個(gè)梯度，每支試管對應(yīng)1個(gè)梯度。反應(yīng)時(shí)間到后，取出加20 % TCA溶液1.0 mL，混勻靜置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混勻，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷卻，8000 r / min、4℃條件下離心 15 min，取上清液在波長532 nm處測定吸光度。比較不同濃度的水浴反應(yīng)時(shí)間對吸光值的影響。

1.2.2 鋸葉棕果油抗脂質(zhì)測定試驗(yàn)

先以無水乙醇作為溶劑，吐溫80作為乳化劑，將鋸葉棕果油配制成1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的果油濃度稀釋液。取7支試管，6支試管各加入相應(yīng)果油濃度稀釋液0.2 mL，剩余的1支試管加入無水乙醇溶劑0.2 mL作為空白對照。按照1.2.1篩選優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行加樣和水浴反應(yīng)，之后取出加20 %TCA溶液1.0 mL，混勻靜置5 min，再加入0.8 %TBA 1.0 mL，混勻，沸水浴10 min后，快速放入冷水中冷卻，8000 r / min、4℃條件下離心 15 min，取上清液在波長532 nm處測定吸光度?？瞻讓φ展芪庵涤洖锳0，樣品管吸光值記為A1，并按照下式來計(jì)算MDA抑制率。

MDA抑制率（ % ） = [（ A0-A1） /A0]× 100

2 結(jié)果與分析

2.1 卵磷脂脂質(zhì)過氧化反應(yīng)條件的篩選

2.1.1 蛋黃卵磷脂濃度的選擇

在固定鐵離子催化劑濃度10 mmol/L和水浴反應(yīng)時(shí)間10 min，所設(shè)置的5個(gè)卵磷脂濃度梯度對整個(gè)過氧化體系的MDA生成影響如圖1所示。

從圖1可以吸光值隨著卵磷脂濃度的提高而不斷升高，且每個(gè)濃度梯度的吸光值存在著顯著性差異。當(dāng)卵磷脂濃度低于5 mmol/L時(shí)，脂質(zhì)過氧化程度較低，MDA的生成量較少，2.5 mmol/L的卵磷脂濃度所表現(xiàn)出的吸光值只有0.277，當(dāng)濃度為5 mmol/L時(shí)，吸光值已經(jīng)達(dá)到0.646，濃度再往7.5 mmol/L提高時(shí)，吸光值已經(jīng)超過0.800。依據(jù)朗伯-比爾定律，吸光值與樣品濃度的線性關(guān)系有效OD值范圍一般是在0.200～0.800之間，數(shù)值超過1.000則會出現(xiàn)較大誤差。為了保證減少試驗(yàn)誤差，先選取吸光值在上述OD值范圍內(nèi)的濃度值。在此基礎(chǔ)上，為了確保添加果油后所產(chǎn)生抑制效果的吸光值不宜過低，因此選取吸光值在0.500～0.800的濃度值作為抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)體系的底物濃度。本次試驗(yàn)，選取卵磷脂濃度為5 mmol/L作為后續(xù)抗氧化試驗(yàn)的底物濃度。

2.1.2 鐵離子催化劑濃度的選擇

在固定蛋黃卵磷脂底物濃度2.5 mmol/L和水浴反應(yīng)時(shí)間10 min，所設(shè)置的5個(gè)鐵離子濃度梯度對整個(gè)過氧化體系的MDA生成影響如圖2所示。

由圖2可以看出，硫酸亞鐵的濃度越高，吸光值也隨之顯著升高，表明了金屬離子催化劑濃度越高，卵磷脂脂質(zhì)過氧化程度越激烈。當(dāng)硫酸亞鐵濃度低于20 mmol/L時(shí)，脂質(zhì)過氧化程度較低，MDA的生成量較少，15 mmol/L的卵磷脂濃度所表現(xiàn)出的吸光值只有0.458，當(dāng)濃度為20 mmol/L時(shí)，吸光值為0.646，而濃度升至25 mmol/L時(shí)吸光值為1.029，吸光值已經(jīng)超過1.000。因此，綜合朗伯-比爾定律及試驗(yàn)結(jié)果分析，選取20 mmol/L硫酸亞鐵來進(jìn)行下一步的抗脂質(zhì)過氧化試驗(yàn)。

2.1.3 水浴反應(yīng)時(shí)間的選擇

在固定蛋黃卵磷脂濃度2.5 mmol/L和鐵離子催化劑濃度10 mmol/L，所設(shè)置的5個(gè)水浴反應(yīng)時(shí)間梯度對整個(gè)過氧化體系的MDA生成影響如圖3所示。

從圖3可以看出吸光值隨著水浴時(shí)間的增加而不斷升高，且每個(gè)時(shí)間梯度的吸光值存在著顯著性差異。當(dāng)水浴時(shí)間低于15 min時(shí)，脂質(zhì)過氧化程度較低，10 min的水浴時(shí)間所表現(xiàn)出的吸光值只有0.251，當(dāng)濃度為15 min時(shí)，吸光值為0.596，而濃度再增加至20 min時(shí)，吸光值為0.805，吸光值已經(jīng)超過0.800。因此，綜合朗伯-比爾定律及試驗(yàn)結(jié)果分析，選取15 min的水浴時(shí)間來進(jìn)行下一步的抗脂質(zhì)過氧化試驗(yàn)。

2.2 鋸葉棕果油抑制卵磷脂過氧化的結(jié)果

根據(jù)2.1優(yōu)化結(jié)果，選取卵磷脂濃度5 mmol/L、硫酸亞鐵濃度20 mmol/L、水浴時(shí)間15 min的試驗(yàn)條件進(jìn)行不同濃度梯度的鋸葉棕果油對抑制蛋黃卵磷脂過氧化效果試驗(yàn)，反應(yīng)中MDA的生成效果如圖4。

由圖4可知，鋸葉棕果油對卵磷脂過氧化的有抑制活性，且抑制率隨著果油濃度的提高而表現(xiàn)出了一種整體下降的規(guī)律性。當(dāng)果油濃度為1.0 mg/mL時(shí)，因脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所產(chǎn)生的吸光值只有0.161，與不加果油的空白對照產(chǎn)生的吸光值0.616相比，表現(xiàn)出了明顯的抑制效果，過氧化抑制率為73.92 %，此時(shí)的抑制率達(dá)到最高。之后隨著濃度的提高，抑制率呈現(xiàn)出下降的趨勢，且高濃度與高濃度的下降差異表現(xiàn)出了顯著性，這表現(xiàn)為果油濃度由8.0 mg/mL升高至10.0 mg/mL時(shí)，相應(yīng)的抑制率從69.21 %下降至65.96 %。出現(xiàn)下降的原因可能是由于鋸葉棕果油中含有大量的硬脂酸和亞油酸，這兩者本身可被金屬離子催化產(chǎn)生自由基，進(jìn)一步過氧化生成MDA，而導(dǎo)致吸光值變大，過氧化抑制率下降，高濃度的果油中硬脂酸及亞油酸就越多，在此基礎(chǔ)上越提高果油濃度，就相當(dāng)于增加了脂質(zhì)過氧化體系中的底物濃度，過氧化程度越高，過氧化抑制率下降就越來越明顯。

3 結(jié)論

本次研究先對蛋黃卵磷脂的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)條件進(jìn)行了篩選試驗(yàn)，主要考察底物濃度、Fe2+離子催化劑濃度、水浴反應(yīng)時(shí)間這三者對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（MDA）生成率的影響。從篩選試驗(yàn)結(jié)果中，確定后續(xù)果油抗氧化試驗(yàn)的反應(yīng)條件，即蛋黃卵磷脂濃度5 mmol/L、硫酸亞鐵濃度20 mmol/L、水浴反應(yīng)時(shí)間15 min。在此反應(yīng)條件下，鋸葉棕果油表現(xiàn)出了較強(qiáng)的脂質(zhì)過氧化抑制能力，且該抑制力隨著果油濃度的升高而降低，果油濃度為1.0 mg/mL時(shí)，過氧化抑制率可達(dá)到73.92 %。本次研究結(jié)果表明鋸葉棕果油對于脂質(zhì)過氧化有著很好的抗氧化活性，濃度越低，活性越好，這為后期鋸葉棕果油進(jìn)一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

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