細(xì)胞表面殼化的研究進(jìn)展

蘇 慧 許 浩張利闖 徐雙夢 魏 延*,,2杜晶晶,2 黃 棣,2

(1太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系,納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心,太原 030024)

(2太原理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究所,材料強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030024)

生物礦化是生物體形成無機(jī)功能礦物的過程,它普遍存在于自然界[1].目前已知很多生物體都可以在有機(jī)基質(zhì)調(diào)控下形成各種各樣的礦化結(jié)構(gòu)來滿足自身需求,例如一些海洋生物利用生物礦物保護(hù)自身不受外界傷害[2],一些植物(硅藻)也可以通過形成二氧化硅細(xì)胞壁對自身進(jìn)行保護(hù)等[3].但自然界中大多數(shù)細(xì)胞并不具有保護(hù)功能的殼層,且細(xì)胞的穩(wěn)定性和功能性易受環(huán)境影響,因此科學(xué)家們提出"仿生礦化"的概念,即用各種材料人為包裹活細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的保護(hù)并賦予細(xì)胞新的功能,Tang等[4]率先在國際上提出"細(xì)胞殼化"的概念,為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能化提供了一條新思路和行之有效的策略.細(xì)胞表面殼化,尤其是單細(xì)胞水平的殼化,可以結(jié)合高精度的顯微成像技術(shù)和高靈敏的傳感技術(shù),從形態(tài)、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白含量、細(xì)胞代謝產(chǎn)物等方面對單細(xì)胞進(jìn)行分析,揭開細(xì)胞功能化及其應(yīng)用的新領(lǐng)域.我們認(rèn)為,通過為活細(xì)胞人工制造殼結(jié)構(gòu)來改進(jìn)細(xì)胞固有的性質(zhì)或賦予細(xì)胞新的功能對人類來說是一個重大的機(jī)遇.基于研究重點(diǎn),本文主要是從單細(xì)胞水平綜合介紹了目前可進(jìn)行殼化的細(xì)胞種類、殼化的方法以及細(xì)胞殼化在環(huán)境與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,并對該領(lǐng)域的研究前景進(jìn)行了展望.

1 可殼化的細(xì)胞類型

雖然細(xì)胞表面功能化的發(fā)展史只有短短幾十年,但是研究者們已在多種細(xì)胞表面實(shí)現(xiàn)了功能化(圖1).酵母菌因其典型的結(jié)構(gòu)與特性,作為生物模型,較先實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞殼化[5].Diaspro等[6]用聚電解質(zhì)PAH/PSS包裹單個酵母菌,并研究了酵母菌的代謝功能及其生長特性等.之后在保證酵母細(xì)胞存活的情況下,進(jìn)行熒光標(biāo)記并導(dǎo)入到草履蟲的體內(nèi),結(jié)果顯示在草履蟲體內(nèi)包被的酵母菌雖然未受保護(hù),但用聚電解質(zhì)在酵母菌表面進(jìn)行殼化的方法是可取的.Tsukruk等[7]使用了一種pH敏感性的包被層包埋酵母細(xì)胞,從而能夠通過調(diào)節(jié)pH值的變化來控制酵母菌的生長.唐睿康課題組[8]研究發(fā)現(xiàn),受多糖細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響,電荷密度較低導(dǎo)致酵母細(xì)胞表面難以直接形成鈣礦物層,而通過層層自組裝的方法引入功能聚合物聚丙烯酸(PAA)后,可顯著提高細(xì)胞礦化能力.因PAA具有高密度的羧酸基團(tuán),為鈣礦物提供了活性成核位點(diǎn).當(dāng)吸附的PAA分子位于酵母細(xì)胞的最外層時,羧酸基團(tuán)向水-聚合物界面遷移并結(jié)合Ca2+離子.在與鈣化溶液接觸后,重組的表面誘導(dǎo)鈣礦物質(zhì)的異質(zhì)成核,細(xì)胞的礦化能力大大提高.

在酵母細(xì)胞上取得成功后,研究者們又轉(zhuǎn)向原核生物領(lǐng)域,在細(xì)菌、孢子、藍(lán)藻、益生菌[9-10]等原核細(xì)胞上也實(shí)現(xiàn)了聚電解質(zhì)膜和無機(jī)礦物殼的包裹.例如,Mirkin等[11]用單層納米金顆粒(gold nanoparticles,AuNPs)包被黑曲霉菌、特異青霉菌、毛霉菌和鏈霉菌的活細(xì)胞體;Johnson等[12]報(bào)道了一種噴霧干燥的方法,將K12大腸桿菌完全封裝在脂質(zhì)二氧化硅納米復(fù)合材料中,發(fā)展了一種新的生物殼化技術(shù);利用基因工程技術(shù)在具有非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的M13噬菌體表面合成混合金鈷氧化物外殼也獲得了成功[13].

圖1 細(xì)胞表面功能化的發(fā)展過程及所應(yīng)用的細(xì)胞種類[11,15,27-36]Fig.1 Development of cell surface functionalization and the types of cells applied[11,15,27-36]

對于高等真核生物細(xì)胞,人們同樣嘗試?yán)蒙餁すこ痰募夹g(shù)對其進(jìn)行表面修飾.早期研究者們在多種類型的動物細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了包裹,包括人血紅細(xì)胞、血小板、胰島細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等[14-21].匡潔等[22]用海藻酸鈉/殼聚糖/海藻酸鈉(ACA)微囊包裹肝細(xì)胞,并對包裹后肝細(xì)胞的功能以及活性進(jìn)行探索,發(fā)現(xiàn)被包埋的肝細(xì)胞可在較短的時間實(shí)現(xiàn)細(xì)胞擴(kuò)增,外周的微殼對肝細(xì)胞的活性無影響,但可阻擋大分子免疫球蛋白,兩者結(jié)合有利于維持肝細(xì)胞白蛋白分泌功能及細(xì)胞活性.近年來,人們對間充質(zhì)干細(xì)胞的研究成為新的熱點(diǎn).此前,對間充質(zhì)干細(xì)胞的封裝主要是通過制備膠原微球來實(shí)現(xiàn)[23],而Etter等[24]利用微流體設(shè)備(MFDS)在人間充質(zhì)干細(xì)胞外制備了均相并且力學(xué)性能可調(diào)的海藻酸鹽微球.基于以上多種生物細(xì)胞表面修飾取得的成功,研究者們思考,能否采用同樣的方法,對難以控制的癌細(xì)胞進(jìn)行某些功能設(shè)計(jì)?宋旸等[25]用親水性的瓊脂糖包裹大鼠的乳腺癌細(xì)胞(SHZ-88),使其在凝膠內(nèi)部生長,并收集其上清液作用于人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7),發(fā)現(xiàn)可以有效抑制人MCF-7細(xì)胞的生長.本課題組的Wei等[26]通過聚電解質(zhì)誘導(dǎo),成功在癌細(xì)胞表面形成人工的礦物質(zhì)外殼,研究發(fā)現(xiàn)這種外殼可能會有效地限制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力.

2 細(xì)胞表面殼化的方法

2.1 層層自組裝法

層層自組裝(LBL)技術(shù),是上世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種簡易、多功能的表面修飾方法,它借助不同層分子之間的相互作用(如靜電力,氫鍵,配位鍵等)逐層交替沉積在帶電模板上,使層與層之間形成穩(wěn)定的具有某種特定功能的分子聚集體或超分子結(jié)構(gòu).這種技術(shù)被認(rèn)為是制備復(fù)合薄膜的一種有效手段,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面包裹納米材料領(lǐng)域[28,37-38](圖 2).

許碧超[39]利用帶相反電荷的PDDA/PSS在大腸桿菌細(xì)胞表面交替沉積形成膜結(jié)構(gòu),靜電作用亦可有效吸附二氧化硅納米粒子在其表面成殼,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的包埋,雖然聚電解質(zhì)復(fù)合膜能夠影響大腸桿菌的形貌,但二氧化硅外殼能夠提高細(xì)胞抵抗?jié)B透壓的能力,且包裹復(fù)合膜的大腸桿菌仍然保持了良好的生長、分裂能力.李文龑[40]用層層自組裝的方法以明膠/藻朊酸為聚電解質(zhì)包裹神經(jīng)干細(xì)胞,并證實(shí)包被的神經(jīng)干細(xì)胞其存活增殖以及分化不會受到明顯的干預(yù),而后利用同樣的技術(shù)將修飾胰島素生長因子-1(IGF-1)的藻朊酸跟明膠包裹在細(xì)胞表面,IGF-1被持續(xù)釋放并呈現(xiàn)pH依賴性.雄鷹等[41]用改性的殼聚糖代替聚賴氨酸為聚電解質(zhì),制備了由海藻酸鈉/殼聚糖包被的SK-OV-3細(xì)胞,將其移植到小鼠的腹腔內(nèi),結(jié)果表明SK-OV-3細(xì)胞在小鼠的腹腔內(nèi)保持良好生長狀態(tài).Carter等[42-43]結(jié)合氫鍵LBL法,利用鞣酸(TA)與聚吡咯烷酮(PVPON)包埋活性酵母細(xì)胞,且包埋后的酵母細(xì)胞活性較高.Yang等[44]運(yùn)用聚多巴胺與酵母細(xì)胞表面蛋白的胺基或巰基的共價鍵作用在酵母細(xì)胞表面包覆成膜,有效地提高了酵母細(xì)胞抵抗溶壁酶的能力.

圖2 在層層自組裝過程中高分子在基底表面吸附過程Fig.2 Polymer adsorption process on the substrate surface during layer upon layer self-assembly

2.2 水凝膠法

生物醫(yī)用水凝膠是一種含有大量親水基團(tuán)而呈現(xiàn)較大的吸水、溶脹特性的三維網(wǎng)狀高分子材料,具備良好的生物相容性和生物可降解性;此外,其質(zhì)地柔軟,可模擬機(jī)體為細(xì)胞粘附、生長等過程提供相似的營養(yǎng)及氣體環(huán)境.細(xì)胞表面水凝膠殼化結(jié)構(gòu)不僅可以降低細(xì)胞治療過程中的免疫排斥反應(yīng),而且可以提高細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.常被用作細(xì)胞表面水凝膠殼化的材料有瓊脂、膠原、海藻酸鹽、多聚賴氨酸等[23,45-48].

目前,以水凝膠作為細(xì)胞外殼化材料修飾干細(xì)胞的方法已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用.商青青等[49]用透明質(zhì)酸水凝膠包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,通過體外、體內(nèi)等實(shí)驗(yàn)表明透明質(zhì)酸水凝膠能夠提高移植細(xì)胞的存活率,且比較移植后4周大鼠的射血分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn),透明質(zhì)酸水凝膠修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到載體后,能夠有效地促進(jìn)大鼠心肌梗死后心功能的改善.李會敏[50]以3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)和N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)為原料,馬來酰化葡聚糖(Dex-Ma)為交聯(lián)劑制備了兼具溫度敏感性和葡萄糖敏感性的水凝膠材料,并用它來包裹胰島瘤細(xì)胞.研究發(fā)現(xiàn),水凝膠-胰島瘤細(xì)胞復(fù)合體系具備糖濃度調(diào)控胰島素分泌模式,為水凝膠體系實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生存環(huán)境的仿真提供了可能.

2.3 溶膠-凝膠法

溶膠-凝膠法,是將化合物通過水解、縮聚等反應(yīng)形成穩(wěn)定的溶膠體系,經(jīng)陳化形成凝膠,最后通過干燥、燒結(jié)等手段制備出具有納米亞結(jié)構(gòu)材料的方法.因其反應(yīng)條件溫和,且可以在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)分子水平的均勻混合,使得其在材料學(xué)、催化劑、色譜分析等領(lǐng)域得到了較為廣泛的發(fā)展.雖然傳統(tǒng)溶膠-凝膠法的反應(yīng)條件已經(jīng)很溫和,但是對于具有活性的生物來說,其反應(yīng)過程具有一定的刺激性.

丁霖等[51]運(yùn)用溶膠-凝膠法制備了金納米粒子-殼聚糖(GNP-CHIT)復(fù)合材料,該復(fù)合凝膠不僅可以有效地固定K562白血細(xì)胞,而且可以在保持細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上,提升細(xì)胞與電極之間的電子傳遞效率.Helen等[52]通過溶膠-凝膠法在細(xì)胞與二氧化硅載體材料之間引入了脂質(zhì)界面,有效地緩解了細(xì)胞在SiO2干燥過程中所受到的作用力,從而降低了細(xì)胞的失活率.隨后,Dickson等[53]和Meunier[54]等利用二氧化硅凝膠良好的光透過性、其介孔結(jié)構(gòu)可傳輸物質(zhì)等特性,將它應(yīng)用于藍(lán)藻、擬南芥細(xì)胞等光合作用的研究中,發(fā)現(xiàn)形成的二氧化硅凝膠外殼可有效地提高光合作用的效率.

2.4 基因修飾法

基因修飾,就是指利用分子生物學(xué)基因工程方法對宿主細(xì)胞的DNA序列進(jìn)行特異性修飾,然后將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞,從而使宿主細(xì)胞的基因型發(fā)生改變,并實(shí)現(xiàn)特定的可遺傳功能化改造.在自然界中,許多天然生物礦物都是由于生物體自身的生物礦化作用產(chǎn)生.例如,雞蛋殼的形成是由于雞蛋殼膜所表達(dá)的角蛋白硫酸鹽誘導(dǎo)碳酸鈣沉積成核,使方解石在其表面生長成殼[55].這一現(xiàn)象啟示我們可以通過在細(xì)胞的可表達(dá)基因序列中引入特殊目的基因來促使細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)表達(dá)以賦予細(xì)胞新的功能.

Takahashi等[56]借助逆轉(zhuǎn)錄酶病毒,將基因注入到人體皮膚細(xì)胞,成功將分化的人體皮膚纖維細(xì)胞改造成與胚胎干細(xì)胞類似的"萬能細(xì)胞",這種技術(shù)能夠用于多種疾病的治療,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生廣泛影響.Müller等[57]將硅礦化基因(Silicatein-α)修飾到大腸桿菌的基因序列中,經(jīng)過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后的大腸桿菌表達(dá)了硅酸鹽蛋白,從而實(shí)現(xiàn)了活性大腸桿菌能夠在硅酸溶液中自發(fā)性硅礦化的功能(圖3).鄭寶玉[58]以人瘦素(human leptin)基因修飾骨質(zhì)疏松大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞與β-磷酸三鈣(β-TCP)結(jié)合構(gòu)建了組織工程化復(fù)合物,該復(fù)合物不僅具有體內(nèi)異位成骨的能力,而且可促進(jìn)患有骨質(zhì)疏松癥大鼠牙周組織缺損處的再生,為牙周組織工程的研究與治療提供了支持.基因修飾法因其可遺傳性得到了較為廣泛的關(guān)注,但基因組容量巨大,基因表達(dá)的不穩(wěn)定性也對該方法的應(yīng)用產(chǎn)生一定的限制.

圖3 大腸桿菌與聚硅酸鹽的封裝方案[57]Fig.3 Scheme of encapsulation of E.coli with poly(silicate)[57]

3 細(xì)胞表面殼化的材料類型

自從在生物細(xì)胞表面進(jìn)行殼化修飾實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能化以來,不同種類的材料被用于細(xì)胞表面殼化賦予細(xì)胞新的功能.細(xì)胞表面功能化所包裹的材料主要分為聚合物、無機(jī)材料、金屬納米粒子以及生物活性分子等[59].

3.1 聚合物

聚合物因其具有豐富的基團(tuán)被用于構(gòu)建細(xì)胞表面殼層,早期主要是以細(xì)胞為模板而獲得多種形狀的聚合物膠囊(capsules)進(jìn)而用在藥物緩釋、組織工程等領(lǐng)域.其中最常用的聚合物是聚電解質(zhì).由于自然界存在的細(xì)胞種類各異而形狀各異,該技術(shù)基于細(xì)胞表面的靜電性質(zhì),需要在帶有微弱電荷的細(xì)胞表面上進(jìn)行聚電解質(zhì)多層自組裝 (因?yàn)榧?xì)胞表面電荷在幾納米厚度的層中分布不均勻,第一層吸附的聚電解質(zhì)不能完全補(bǔ)償細(xì)胞表面這種空間分布的表面電荷),最終在細(xì)胞表面形成了聚電解質(zhì)殼,隨后細(xì)胞溶解,得到大小和形狀可控的聚電解質(zhì)微膠囊,這在本質(zhì)上復(fù)制了原始細(xì)胞的形態(tài).一般來說,聚電解質(zhì)微膠囊殼層特性會由模板細(xì)胞類型、消化過程、聚電解質(zhì)種類的性質(zhì)、溶液性質(zhì)等因素決定.包裹了聚電解質(zhì)的細(xì)胞表面電荷可以反轉(zhuǎn) (正變負(fù)、負(fù)變正)、細(xì)胞表面可以根據(jù)應(yīng)用要求變得或疏松或致密、細(xì)胞表面的滲透性也可調(diào)控(0.1~15 nm的孔徑)[60-61].聚電解質(zhì)因所帶電荷不同可以分為聚陽離子和聚陰離子兩種,其中常用的聚陽離子化合物有:聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA),聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH),聚乙烯亞胺(PEI),聚多巴胺(PDA),聚賴氨酸(ε-PL)以及殼聚糖(CHI)等;而聚陰離子化合物有:聚苯乙烯磺酸鈉(PSS),聚丙烯酸(PAA),聚谷氨酸(Glu)以及明膠(GE)等.

聚合物材料不僅成功用于細(xì)胞表面殼層的構(gòu)筑,還能夠作為催化模板,誘導(dǎo)無機(jī)納米材料在細(xì)胞表面形成無機(jī)殼層.以往的研究發(fā)現(xiàn),電子相互作用是生物礦化的關(guān)鍵因素[62-63].一般認(rèn)為,在生物定向礦化作用中最活躍的蛋白質(zhì)含有富含羧基或其他帶電官能團(tuán)的區(qū)域[64-65].通過在細(xì)胞表面構(gòu)建帶有羧基的聚電解質(zhì)殼層,將會促進(jìn)細(xì)胞表面生物仿生礦化的發(fā)生,這也是獲得良好無機(jī)殼層的前提.后來的研究中發(fā)現(xiàn),聚電解質(zhì)包裹細(xì)胞之后會改變細(xì)胞某些功能,具體的機(jī)理目前揭示較少,推測是因?yàn)榫垭娊赓|(zhì)影響細(xì)胞表面關(guān)鍵蛋白的分泌,進(jìn)而影響信號分子順利表達(dá).Diaspro等[5]用層層自組裝技術(shù),將PAH/PSS成功封裝在酵母細(xì)胞表面;Yang等[44]成功地在酵母細(xì)胞表面包裹了功能性的多巴胺殼,研究表明,多巴胺包裹的酵母細(xì)胞具有良好的生物活性,但相較于未修飾的細(xì)胞,細(xì)胞分裂的滯后期隨著包裹層數(shù)的增加而增加;Tabrizin等[28]用天然聚電解質(zhì)(殼聚糖、海藻酸、透明質(zhì)酸、寡核苷酸)在大腸桿菌細(xì)胞表面進(jìn)行了殼化;Wu等[66]報(bào)道了一種通過明膠和聚乙二醇交聯(lián)實(shí)現(xiàn)對單個Hela細(xì)胞納米封裝的溫和方法.這些實(shí)驗(yàn)均顯示出用聚電解質(zhì)包裹的細(xì)胞仍具有良好的生物活性.

3.2 無機(jī)材料

自然界的生物在億萬年進(jìn)化過程中,都有一套完整的保護(hù)程序,細(xì)胞表面具有細(xì)胞膜,一些細(xì)胞還有較厚的、力學(xué)性能更好的保護(hù)殼,例如雞蛋、硅藻、貝類等.但是一些生物細(xì)胞并不具備以上的特征,因表面缺乏可以成殼的基團(tuán)而無法自身殼化.面對日益嚴(yán)峻的氣候變化以及生物醫(yī)學(xué)研究的要求,研究者從自然界得到啟發(fā),結(jié)合聚合物殼的易操作性,基于生物仿生礦化技術(shù),可先在細(xì)胞表面構(gòu)建聚合物殼層為無機(jī)礦物提供成核位點(diǎn),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)無機(jī)礦物殼層的包覆[67],保護(hù)細(xì)胞免受極端環(huán)境的刺激,甚至還在細(xì)胞貯存、疫苗保存以及異體輸血等領(lǐng)域都有較多的應(yīng)用.目前,應(yīng)用于細(xì)胞表面功能化的無機(jī)材料主要有碳酸鈣[8,68]、磷酸鈣[69-71]、二氧化硅[72-74]、氧化鋅、碳納米管、石墨烯以及四氧化三鐵等.這些無機(jī)材料因其所具有的特殊理化性質(zhì)備受關(guān)注,例如碳酸鈣和磷酸鈣是人體主要的鈣源,是一些組織器官的組成部分,具有良好的生物相容性,本課題組研究人員制備了多種晶型納米羥基磷灰石,并研究了其在人體骨修復(fù)等領(lǐng)域的應(yīng)用[75-81];氧化鋅具有一定的抗菌性;碳納米管跟石墨烯具有良好的導(dǎo)電性;四氧化三鐵具有較強(qiáng)的磁性等等.由于所選模板細(xì)胞不同、所需功能不同,故而沉積的無機(jī)材料也不同,研究表明,調(diào)控鈣礦化的通常 都含有羧基(-COOH)[63,82-85],而調(diào)控硅礦化的通常帶有(-NH2)或-NH-[68,86-92].

圖4 (a)酵母細(xì)胞去除后的碳酸鈣中空微膠囊的電鏡圖[93];(b)將酵母細(xì)胞固定在玻碳電極上的示意圖[68];(c)NP在WSG-Fe3O4-SK-OV-3上分布的透鏡圖[95]Fig.4 (a)Electron microscopy of calcium carbonate hollow microcapsules removed from yeast cells[93];(b)Schematic representation of the immobilization of yeast cells onto glassy carbon electrodes[68];(c)Lens diagram of NP distribution on WSG-Fe3O4-SK-OV-3[95]

Fakhrullin等[93]還直接將碳酸鈣沉積在酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁上,將單個活酵母細(xì)胞封裝在CaCO3微殼中,制備了細(xì)胞-無機(jī)核-殼的混合微粒子(圖4a),證明了用碳酸鈣包覆細(xì)胞的可行性.另外Fakhrullin等[68]還用聚電解質(zhì)逐層組裝的方法將碳納米管包裹在聚電解質(zhì)PAA/PSS包裹的釀酒酵母細(xì)胞的表面,然后又包裹了雙層聚電解質(zhì)(圖4b),研究證明,包裹的細(xì)胞有良好的生物活性,最后,采用伏安法和電化學(xué)阻抗法進(jìn)行了電化學(xué)研究,表明復(fù)合聚電解質(zhì)/多壁碳納米管涂層的酵母細(xì)胞與人工電子受體之間有足夠的電子介導(dǎo)作用,從而有可能區(qū)分細(xì)胞的死活.Xiong等[94]在藍(lán)藻上誘導(dǎo)形成人工仿生硅化外殼,發(fā)現(xiàn)并證明被二氧化硅包裹的藍(lán)藻細(xì)胞在高光照的條件下體現(xiàn)出更強(qiáng)的光合作用能力,二氧化硅殼層不僅起到了保護(hù)細(xì)胞的作用,而且有助于生物質(zhì)的積累,對生物能源的利用有重要的意義.Huang等[69]還用層層自組裝的方法制備了由磷酸鈣包覆的酵母細(xì)胞,通過高溫煅燒去除酵母細(xì)胞得到粒徑均勻的磷酸鈣多孔微膠囊,可用于載藥或與其他多功能材料結(jié)合作為組織工程支架.Dzamukova等[32]報(bào)道了利用超順磁陽離子納米粒子通過單步生物相容性過程來實(shí)現(xiàn)在活的HeLa細(xì)胞表面的簡單功能化,磁性納米粒子被固定在細(xì)胞膜上,不會穿透細(xì)胞質(zhì).通過外部磁場的控制,被磁性納米粒子包裹的HeLa細(xì)胞可以在某些特定的位置上進(jìn)行空間積累,并在這些位置進(jìn)一步生長.本課題組的Wei等[95]制備了包覆WSG肽的Fe3O4納米粒(NPS),對其磁化強(qiáng)度與細(xì)胞相容性進(jìn)行測試,并將其組裝到癌細(xì)胞的表面,結(jié)果表明包覆WSG肽的NPS具有靶向腫瘤的特性,可用于腫瘤診斷與治療領(lǐng)域(圖4c).

3.3 金屬納米粒子

金屬納米粒子自發(fā)現(xiàn)以來引起了廣泛的關(guān)注,它所具有的特殊的性質(zhì)使其在生物細(xì)胞表面功能化領(lǐng)域占據(jù)重要的地位.不同的金屬納米粒子往往具有不同的功能,在細(xì)胞表面包裹這些納米金屬材料可以賦予細(xì)胞某些特殊的性質(zhì)[96],比如金納米粒子聚集產(chǎn)生從紅到藍(lán)的顏色變化被用于DNA的檢測[97];納米銀粒子具有廣譜的抗菌性能在生物醫(yī)學(xué)等方面具有廣泛的應(yīng)用[98];鈀納米粒子作為Suzuki反應(yīng)的催化劑越來越受人關(guān)注[99].

姚成立等[100]在酵母細(xì)胞有氧呼吸的過程中結(jié)合維生素C用LBL的方法在其表面制備了銀質(zhì)外殼,結(jié)果表明,制備的銀質(zhì)外殼可以有效地保護(hù)酵母菌不被化學(xué)試劑毒害.Fakhrullin等[101]報(bào)道了一種用PAH/PSS在釀酒酵母和曲霉上包裹牛血清白蛋白/DNA和檸檬酸修飾的金和銀納米粒,結(jié)果表明,納米粒子有效地結(jié)合在相對帶電的聚電解質(zhì)層之間,改變了細(xì)胞壁的形貌和粗糙度,并且被包裹的細(xì)胞保留了它們的生存能力.馬廣磊[102]通過加熱還原,紫外還原,水合肼還原等幾種不同的方法成功將Ag納米粒子和Pd納米粒子包載于酵母細(xì)胞和巨大芽孢桿菌細(xì)胞中.這個研究可以進(jìn)一步用于將金屬納米粒子導(dǎo)入巨噬細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的金屬催化反應(yīng),同時酵母細(xì)胞為催化劑提供了新的生物載體,與銀結(jié)合可以形成一種新的具有良好生物相容性的抗菌材料.

3.4 生物分子

生物分子具有生物活性、生物相容性以及可降解性等天然優(yōu)勢且含有豐富的活性基團(tuán),有利于與功能基團(tuán)結(jié)合,是細(xì)胞表面功能化重要的材料來源,但又因?yàn)槠浞€(wěn)定性低等缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)用與普及,所以目前關(guān)于在細(xì)胞表面進(jìn)行生物分子殼化的報(bào)道并不多[71,103-105].

Drachuk等[106]展示了一種高效的封裝方法,成功將蠶絲蛋白納米殼包裹在酵母菌表面(圖5).與傳統(tǒng)的人工殼層相比,這種蠶絲蛋白納米殼層有助于細(xì)胞的初始保護(hù),并允許它們在封裝一段時間后再被細(xì)胞完全降解.Matsuzawa等[107]將纖連蛋白和明膠形成的復(fù)合物以及Ⅳ型膠原和層粘連蛋白形成的復(fù)合物通過層層自組裝方法包裹在肝癌細(xì)胞表面,相比于傳統(tǒng)的聚電解質(zhì)包裹的細(xì)胞,在離心多次后其生物活性仍是傳統(tǒng)的1.4倍.生物分子具有可降解功能和生物適應(yīng)性,在細(xì)胞輸送領(lǐng)域具有潛在的研究價值,另外若在殼層中引入細(xì)胞生長因子也能夠提高細(xì)胞的生物活性.

圖5 用LBL方法將蠶絲蛋白納米殼包裹在酵母菌表面的示意圖[106]Fig.5 Schematic representation of silk-on-silk LbL deposition to form silkⅡrich structure on the surface of yeast cells[106]

3.5 雜化復(fù)合物

一般雜化復(fù)合物包含2種或2種以上不同的材料,因其所具有的多種功能而吸引了研究者的目光[108-110],很多研究者嘗試在生物細(xì)胞表面包裹復(fù)合物以賦予細(xì)胞多種功能.

Choi等[111]在硅酸衍生物的仿生縮聚過程中加入(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS),將硫醇官能團(tuán)直接摻入二氧化硅殼中,通過多肽作用將二氧化硅/二氧化鈦納米復(fù)合物固定于酵母細(xì)胞表面形成納米復(fù)合殼,殼化后的細(xì)胞不僅保持了原有的生物活性,其熱穩(wěn)定性也顯著提高(圖6),這恰恰也證明了二氧化硅和二氧化鈦的協(xié)同作用能夠賦予細(xì)胞更多的功能.此外,Choi等[112]還在酵母細(xì)胞表面構(gòu)建了鞣酸與Fe3+離子形成的納米復(fù)合物殼層.這種殼層不僅能夠保護(hù)細(xì)胞免受紫外輻射、溶菌酶裂解的影響,而且還能通過降解殼層控制細(xì)胞分裂,實(shí)現(xiàn)化學(xué)上的"孢子形成"和"出芽生殖".姜楠等[113]在酵母細(xì)胞表面構(gòu)建了由涂有L-半胱氨酸的金納米粒子和自組裝無定形二氧化硅的生物混合層組成的雙層納米殼,與傳統(tǒng)的聚電解質(zhì)膜相比,該殼層有更好的生物相容性,同時它能夠?qū)щ姾痛判怨δ芑?用于保護(hù)細(xì)胞免受多種刺激.

4 細(xì)胞表面殼化的應(yīng)用

由于能夠通過細(xì)胞表面殼化來賦予細(xì)胞功能的材料多種多樣,其實(shí)現(xiàn)的功能也各不相同,且加上不同種類細(xì)胞的特性也不同,故細(xì)胞表面殼化的應(yīng)用領(lǐng)域也十分廣泛,包括生物、化學(xué)、能源或醫(yī)療等方面.這些領(lǐng)域相互交叉,根據(jù)常用領(lǐng)域在這里可大體分為兩大類,一類是能源、環(huán)境領(lǐng)域,另一類則是生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[114].

4.1 能源、環(huán)境領(lǐng)域

4.1.1 環(huán)境治理

圖6 將單個酵母細(xì)胞封裝在硫醇功能化二氧化硅(SiO2)殼內(nèi),并在SiO2殼上引入熒光素或鏈霉菌素[111]Fig.6 Encapsulation of individual yeast cells in the thiol-functionalized silica(SiO2SH)shells and the introduction of fluorescein or streptavidin onto the SiO2SHshells[111]

隨著工業(yè)的發(fā)展,環(huán)境污染問題也日益嚴(yán)重,大量含有氮、磷的廢污水造成的水華現(xiàn)象以及重金屬污染對人們的日常生活造成嚴(yán)重的威脅.因此如何處理好被污染的廢水成了一個難題.很多研究者將目光轉(zhuǎn)向了生物去污的方向.生物去污是一種利用生物體(例如植物[115]、微生物)將污水中重金屬離子等去除的方法,與傳統(tǒng)的治污方法相比,它的成本較低且環(huán)保有效[116-118].江慧[119]用海藻酸鈉-明膠-聚乙烯醇包埋酵母菌,并對其吸附重金屬的能力進(jìn)行研究.Yang等[120]報(bào)道了一種在正常生長條件下,利用Ca2+與CO2的內(nèi)源反應(yīng)在酵母細(xì)胞表面制備功能性CaCO3支架的方法(圖7),并以Pb2+為例,進(jìn)一步研究了功能化細(xì)胞去除重金屬的能力.實(shí)驗(yàn)證明,對比普通酵母細(xì)胞,功能化的細(xì)胞對Pb2+的吸附能力要大于酵母細(xì)胞.此外,CaCO3和PbCO3之間的沉淀轉(zhuǎn)化可能只發(fā)生在功能化細(xì)胞中,最重要的是,這種方法能有效地去除水溶液中的微量雜質(zhì).這種在細(xì)胞表面構(gòu)筑殼層實(shí)現(xiàn)功能化的方法不僅能夠提高細(xì)胞的去污能力,而且有可能實(shí)現(xiàn)更多的功能,例如選擇性地降解污染物、實(shí)現(xiàn)除污細(xì)胞的快速分離等[110],在環(huán)境保護(hù)中具有重要的應(yīng)用價值.針對水華現(xiàn)象,盧瑞瑞[121]探究了納米材料TiO2光催化對藻類細(xì)胞(依藻,微囊藻)的影響,發(fā)現(xiàn)納米TiO2光催化作用在紫外光照射下比在自然光光照下對藻類細(xì)胞破壞大,而且照射時間越長破壞越大.熊威[122]則以微囊藻細(xì)胞作為模型,利用帶胺基的陽離子聚電解質(zhì),實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與二氧化硅納米顆粒的快速結(jié)合.二氧化硅修飾的微囊藻細(xì)胞迅速變?yōu)榫奂瘧B(tài),并在短時間內(nèi)完全沉降到水底.沉降到水底的微囊藻細(xì)胞,不僅光合生長受到抑制,而且?guī)缀跬Ｖ贯尫旁宥舅?該研究為預(yù)防水華提供了一種安全有效、成本低廉的策略.

4.1.2 生物電池

由于過度的開發(fā)濫用,能源危機(jī)日益嚴(yán)重,為滿足人們對能源的需求,生物電池應(yīng)運(yùn)而生.眾所周知,單細(xì)胞生物內(nèi)含有大量的碳、氮化合物,是天然的碳源和氮源[123].在細(xì)胞表面功能化之后,吸附了金屬離子的生物細(xì)胞經(jīng)過碳化處理可以得到金屬或金屬氧化物與碳的復(fù)合材料,這種材料具有良好的導(dǎo)電性,是用來制造生物電池的一種新選擇[124].Du等[125]以酵母菌作為介孔結(jié)構(gòu)模板合成了Li3V2(PO4)3/C微球,其中釩陽離子與帶負(fù)電荷的親水性基團(tuán)結(jié)合,分別通過靜電相互作用和代謝調(diào)節(jié)在酵母細(xì)胞壁表面和細(xì)胞內(nèi)部自組裝.該微球具有較高的比表面積和合理的孔徑分布,大幅度增加了儲鋰活性,同時也縮短了鋰離子遷移和擴(kuò)散的距離.Yin等[126]將酵母和石墨烯等混合在還原性氣氛下經(jīng)高溫碳化得到了具有三維構(gòu)造的碳/石墨烯(3D-NHPC/G)復(fù)合材料(圖8),該材料具有很高的電子傳遞能力,是制作超級電容器電極的理想材料.還有一些細(xì)胞本身就具有帶電的性質(zhì),像是某些發(fā)電的魚類[127]中與發(fā)電相關(guān)的細(xì)胞都可以進(jìn)行修飾成為性能更佳的生物電池.這些生物電池利用了自然界的生物體將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能,因其綠色高效得到了大家的認(rèn)可,具有廣闊的應(yīng)用前景[128].

圖7 內(nèi)源性生成碳酸鈣納米顆粒支架的功能化細(xì)胞的形成機(jī)制[120]Fig.7 Formation mechanism of functionalized cell with endogenous production of CaCO3nanoparticle scaffold[120]

圖8 三維構(gòu)造的碳/石墨烯(3D-NHPC/G)復(fù)合材料的制備工藝[126]Fig.8 Procedure for the fabrication of 3D-NHPC/G[126]

4.2 生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

4.2.1 細(xì)胞保護(hù)與保存

細(xì)胞的功能性外殼像件外衣,將細(xì)胞緊緊地包裹住,但同時它還具有一定的滲透性,被包裹的細(xì)胞與外界仍能進(jìn)行物質(zhì)交換.即使外界環(huán)境惡劣,被修飾的細(xì)胞都能在免受外界傷害的同時保持一定的活性.通過改變在細(xì)胞表面所包裹的材料種類,可以保護(hù)細(xì)胞免受多種傷害[72,94,113].Zhao等[129]通過設(shè)計(jì)納米材料作為人工細(xì)胞器,來消除細(xì)胞毒性.研究發(fā)現(xiàn)金寡核苷酸(Au-ODN)組成的納米復(fù)合材料可以捕獲標(biāo)準(zhǔn)化療藥物阿霉素(DOX),阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞核.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,Au-ODN納米材料可以選擇性地富集在肝細(xì)胞內(nèi),消除了氧化還原引起的肝毒性,提高了細(xì)胞抵抗化療環(huán)境威脅的能力(圖9).這一研究表明,將功能材料作為生物細(xì)胞器引入生命系統(tǒng),可能是保護(hù)細(xì)胞在更復(fù)雜條件下生存和制造超級細(xì)胞的新策略.Wang等[130]在斑馬魚的囊胚期成功在其表面誘導(dǎo)沉積了一層可以吸收紫外線的磷酸鑭鈰鋱礦化層.實(shí)驗(yàn)證明,在短時間高功率和長時間低功率的紫外輻射的情況下,人工礦物殼可以有效地吸收紫外線輻射,從而保持胚胎狀況良好;相比之下,未被包膜的胚胎在此情況下無法存活.另外在細(xì)胞存儲方面,目前所常用的液氮冷凍保存的方法會對細(xì)胞造成很大的傷害,往往有部分細(xì)胞無法復(fù)蘇而凋亡,因此設(shè)想能否采用生物殼化的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞室溫下的長期保存[67].Wang等[131]以一株日本腦炎減毒活病毒為模型,在生理?xiàng)l件下,通過仿生原位礦化手段用磷酸鈣誘導(dǎo)病毒發(fā)生礦化,在不改變疫苗原有的生物活性及感染功能的情況下,合理設(shè)計(jì)了熱穩(wěn)定疫苗.這一實(shí)驗(yàn)在疫苗的常溫保存方面有重要的意義.

圖9 Au-ODN的結(jié)構(gòu)示意圖及其作為細(xì)胞內(nèi)納米材料細(xì)胞器的工作原理[129]Fig.9 Schematic of construction of Au-ODN and its working principle as nanomaterials based organelle within the cell[129]

4.2.2 細(xì)胞輸送與治療

細(xì)胞治療是指利用某些具有特定功能的細(xì)胞特性,將經(jīng)過生物工程手段處理過的健康細(xì)胞靶向運(yùn)輸?shù)绞軗p器官或組織,從而達(dá)到治療疾病的目的.根據(jù)人們的需求,利用生物殼工程的手段在細(xì)胞表面形成殼層能夠提高細(xì)胞運(yùn)輸?shù)男?而且通過在細(xì)胞表面增加功能基團(tuán)能夠使細(xì)胞與藥物特異性結(jié)合,實(shí)現(xiàn)藥物的定點(diǎn)釋放,大大提高細(xì)胞治療效率.另外細(xì)胞殼化還為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的操縱治療提供了可能[110],例如,人工在干細(xì)胞表面包裹納米磷酸鈣顆粒,不僅可以保護(hù)細(xì)胞,而且可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,是一種理想的骨修復(fù)活性材料[132-133];在細(xì)胞表面引入磁性納米殼層也能夠在外加磁場作用下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞治療可控地快速傳遞與分離[134];可以設(shè)計(jì)形成人造礦物外殼來包圍癌細(xì)胞,使得癌細(xì)胞與底物之間的關(guān)聯(lián)受到干擾或抑制,并由于人造礦物外殼的限制,癌細(xì)胞的運(yùn)動能力會被削弱或抑制[26].Zhao等[135]提出癌細(xì)胞靶向鈣化(CCTC)的方法,選擇葉酸受體(FR)過表達(dá)的HeLa細(xì)胞,來吸附葉酸(FA)分子,然后在局部富集Ca2+,誘導(dǎo)特定的細(xì)胞鈣化,并由此產(chǎn)生的鈣礦物包裹癌細(xì)胞,誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡.研究結(jié)果表明,與傳統(tǒng)化療相比,CCTC治療可以有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,而不損害正常細(xì)胞.這一成果可能代表了一種用選擇性鈣化替代硬化治療腫瘤疾病的方法(圖10).Zhu等[136]選擇硫酸軟骨素作為最佳靶劑和連接劑,誘導(dǎo)外源Ca2+和CO32-原位生物礦化,生成靶向癌細(xì)胞膜的生物相容性碳酸鈣(CaCO3)納米結(jié)構(gòu).研究發(fā)現(xiàn),生成的CaCO3納米結(jié)構(gòu)可阻斷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,導(dǎo)致線粒體膜電位崩潰,乳酸脫氫酶釋放增加,最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡.這一研究可能為癌癥的有效和特異性治療帶來希望.

此外,還有研究者們將殼化后具有特殊功能的細(xì)胞用于生物催化[137]、生物檢測與成像[138]、生物傳感器[139-141]和制作細(xì)胞芯片[142-143]等方面,細(xì)胞殼化在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有更為廣泛的應(yīng)用價值.

圖10 (a,b)HEK293和Hela細(xì)胞經(jīng)過FA選擇性介導(dǎo)靶向鈣化后的鈣化率;(c)經(jīng)不同處理后細(xì)胞活力的定量分析(**P<0.01);(d)腫瘤小鼠經(jīng)DOX和CCTC治療后的存活率(n=10)[135]Fig.10 (a,b)Calcification rate of HEK293 and Hela cells after FA selectively mediated targeted calcification anticancer therapy by CCTC;(c)Quantitative analysis of cell viability with different treatments(**P<0.01);(d)Survival rates of tumor mice after DOX and CCTC treatment(n=10)[135]

5 展 望

細(xì)胞表面殼化技術(shù)從建立到發(fā)展,盡管還不到20年的時間,但是該技術(shù)的研究極大地促進(jìn)了化學(xué)、生物、材料以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)展.細(xì)胞表面殼化不僅可以修飾細(xì)胞,使其獲得新功能,同時也可以以細(xì)胞為模板制得新材料,還可以為揭示納米材料與細(xì)胞間的相互作用提供有效手段.細(xì)胞表面殼化技術(shù)未來前景廣闊,可以通過革新殼化技術(shù)方法、殼化材料、細(xì)胞種類、應(yīng)用領(lǐng)域等來實(shí)現(xiàn).

在細(xì)胞表面殼化技術(shù)方法上,傳統(tǒng)方法為水凝膠法和溶膠-凝膠法,可以使細(xì)胞外殼較靈活應(yīng)用,后來發(fā)展為層層自組裝法和原位礦化法,能為細(xì)胞表面提供良好的機(jī)械性能和穩(wěn)定性.隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展,細(xì)胞可以通過插入外界基因而在細(xì)胞表面合成相應(yīng)礦化相關(guān)多肽,從而被礦化修飾.此方法可以得到多種人工外殼,應(yīng)用靈活,但是插入基因后細(xì)胞具有遺傳性,也必將存在生物安全性問題.除此之外,通過人工設(shè)計(jì)3D打印機(jī)可以在細(xì)胞表面打印出所需復(fù)合殼層,在細(xì)胞和組織培養(yǎng)、藥物緩釋、組織工程等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力.另外,對自然界生物過程的理解也將促進(jìn)殼化技術(shù)的發(fā)展,例如自然界的硅化和多巴胺的自聚合等.

在殼化材料的種類上,目前多數(shù)為聚電解質(zhì)和簡單納米粒子,在材料的選擇上,最基本的要求是對細(xì)胞低毒或者無毒、不改變細(xì)胞的遺傳信息等.而隨著功能納米材料和智能聚合物的快速發(fā)展,研究者會選擇新型多功能復(fù)合納米材料應(yīng)用于細(xì)胞表面殼化,例如具有雙重功能的納米材料(janus nanoparticles)或基于環(huán)境(pH、磁性、溫度、濕度以及離子強(qiáng)度等)響應(yīng)的多功能納米粒子或納米管的復(fù)合材料.當(dāng)然,使用何種材料需要根據(jù)對象細(xì)胞以及使用目的來選擇.可以預(yù)見,未來的細(xì)胞表面殼化技術(shù)不會是簡單的將納米材料沉積到細(xì)胞表面,而是需要引發(fā)細(xì)胞表面對環(huán)境變化的反應(yīng).也就是說,表面的殼層具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)多變等特性.

在殼化細(xì)胞類型上,盡管細(xì)胞殼化工程采用了所有主要分類群的細(xì)胞代表,但使用的物種數(shù)量卻非常有限.在將來,必將有新的物種細(xì)胞作為殼化的對象或模板.尤其是人類細(xì)胞的殼化將會越來越多,這與人類健康密切相關(guān).目前有研究對部分癌細(xì)胞殼化成功且有效抑制癌細(xì)胞相關(guān)生理活動,證實(shí)細(xì)胞殼化方法在體外抑癌有效,但是在復(fù)雜的體內(nèi),殼化難度加大,尤其是能否成功靶向殼化是該技術(shù)的瓶頸.

在應(yīng)用領(lǐng)域,細(xì)胞表面殼化技術(shù)無疑會越來越廣闊.目前,細(xì)胞表面殼化主要應(yīng)用于細(xì)胞存儲、細(xì)胞保護(hù)、生物檢測、生物治療等領(lǐng)域.除此之外,在多種細(xì)胞表面殼化可以制造一種單一的環(huán)境,進(jìn)而在研究多種單細(xì)胞的生理活動和遺傳信息等領(lǐng)域都具有較大的應(yīng)用前景.另外,細(xì)胞表面的殼化層會影響細(xì)胞的功能性,控制殼化層的功能進(jìn)而可以得到功能型細(xì)胞,或許可以誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化,產(chǎn)生所需要的特定功能的細(xì)胞或者組織,這將極大地促進(jìn)生物、醫(yī)學(xué)學(xué)科的發(fā)展.

當(dāng)然,細(xì)胞表面殼化技術(shù)目前也存在著很多問題,比如,目前多數(shù)材料對細(xì)胞有毒性、殼化后的細(xì)胞會有免疫源性、細(xì)胞對殼化的材料有一定的排斥性、外殼改變細(xì)胞某些生物學(xué)功能的機(jī)理不清楚等.因此,要解決上述問題、拓展細(xì)胞表面殼化技術(shù)領(lǐng)域,需要表面工程、材料科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)等各個相關(guān)領(lǐng)域的交叉研究[144].