脫乙酰基酶在枯草芽孢桿菌中的高效可溶性表達

王遠山，龔美華，曹成浩，薛亞平

1(生物有機合成浙江省重點實驗室(浙江工業大學)，浙江 杭州，310014)2(教育部生物轉化與生物凈化重點實驗室(浙江工業大學)，浙江 杭州，310014 3(手性生物制造國家地方聯合工程研究中心(浙江工業大學)，浙江 杭州，310014)

脫酰基酶(decetylase,EC 3.5.1.X)是一類能夠催化底物脫去酰胺的水解酶，其中脫乙酰基酶是一類能催化幾丁質或蛋白質水解脫去乙酰基，形成殼聚糖或脫乙酰基蛋白質的水解酶[1-2]。脫酰基酶廣泛存在于動物、植物以及微生物體內，被應用于酰基化的化合物手性拆分，以生產光學純的醫藥、臨床、食品等領域的產品或者中間體，工業應用前景廣闊[3-5]。如殼聚糖脫乙酰基酶可以用于水解甲殼素制備殼聚寡糖[6-8]。來源于鏈霉菌(Streptomycespulverzceus)的棘白霉素B(ECB)脫酰基酶[9-11]可催化ECB脫酰基獲得棘白霉素B母核。然而，像絕大多數外源基因一樣，脫乙酰基酶基因在大腸桿菌、酵母菌等表達系統中高效表達時，易在細胞內凝集，形成不溶的、無活性、高密度、無定形[12]、非水溶性、可溶于變性劑物質如尿素、鹽酸胍的包涵體[13]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其無致病性、遺傳背景清晰、分泌蛋白能力強、培養條件簡單、耐高溫等優點，成為異源表達和分泌外源蛋白的理想宿主[14-16]。目前利用枯草芽孢桿菌表達脫乙酰基酶的研究基本未見報道，因此，可以嘗試利用枯草芽孢桿菌的組成型分泌表達系統可溶性表達脫乙酰基酶。

本實驗室已篩選到一個能夠立體選擇性水解乙酰化氨基酸生產L-氨基酸的脫乙酰基酶NAP-Das 2.3，但在E.coli表達系統中會形成大量包涵體。為實現高效表達，本文參考相關文獻[17-20]，將NAP-Das 2.3編碼基因克隆至枯草芽孢桿菌構建重組工程菌，優化了工程菌的培養及產酶條件，實現了異源高效可溶性表達，為脫乙酰基酶的開發和應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

pP43NMK質粒，南京農業大學農業部農業環境微生物工程重點開放實驗室贈送；E.coliJM109和B.subtilisWB800，本實驗室保藏。

1.1.2 主要工具酶、試劑和試劑盒

限制性內切酶XhoI、BamHI、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpress?II一步克隆試劑盒等，Vazyme公司；質粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產物純化試劑盒等，Axygen生物技術有限公司；DNA Marker、protein Marker、TaqDNA Polymerase、染色劑Gold View等，TaKaRa公司；卡那霉素、氨芐青霉素等，大連寶生物公司；溶菌酶，生工生物工程(上海)有限公司；其他試劑為進口或國產。

1.1.3 主要儀器和設備

Biometra PCR儀，Biometra公司；SevenMulti pH計，瑞士Mettler-Toledo；Sorvall Lynx 4 000高速冷凍離心機，Thermo Scientific公司；5 L全自動發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；Mini-Protean II型電泳儀、GelDoc凝膠成像儀，Bio-Rad公司；30 kDa超濾離心管，Millipore公司；BioLogic LP蛋白純化儀，美國Bio-Rad公司；5417R小型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。MS-100恒溫金屬振蕩反應器，杭州奧盛儀器有限公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀，美國Thermo公司；ExpressPlusTM聚丙烯酰胺蛋白預制膠，金斯瑞生物科技有限公司；UltiMate3000高效液相色譜，美國戴安公司。

1.2 實驗材料

1.2.1 脫乙酰基酶編碼基因的獲得及其重組表達載體的構建和鑒定

脫乙酰基酶編碼基因nap-das2.3由本實驗室以Arenimonasmalthae的amidohydrolase(GenBank登錄號WP 043803585.1)為模板合成，克隆至載體pET 28b(+)的限制性酶切位點XhoI和BamHI之間，并將重組質粒pET 28b/nap-das2.3轉入E.coliBL21，獲得重組菌E.coliBL21/pET 28b/nap-das2.3。將E.coliBL21/pET 28b/nap-das2.3及實驗室保藏的E.coliDH5α/pP43NMK用AxyPrep質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒。重組質粒pET 28b/nap-das2.3用XhoI、BamHI酶切獲得目的基因片段nap-das2.3。根據載體pP43NMK上目的基因插入位點兩端的序列及nap-das2.3序列設計PCR引物。插入片段擴增引物(F1/R1)，上游引物F1：5′-GTAAGAGAGGAATGTACACATGATTAGATGGAGCTTTCAA-3′；下游引物R1：5′-CCTTTCGCCCGTCACTCAAGTGGTTGTTGTTAGAAGAGTA-3′。線性化克隆載體的擴增引物(F2/R2)，上游引物F2：5′-CATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGATT-3′；下游引物R2：5′-CCTTTC GCCCGTCACTCAAGTGGTTGTTGTTAGAA-3′。PCR反應采用50 μL體系，PCR反應條件為：98 ℃、3 min；98 ℃、10 s；65 ℃、15 s；72 ℃、20 s，30個循環；71 ℃、10 min，隨后用DpnI消化10 min降解擴增模板后置于65 ℃加熱20 min使DpnI失活。線性化克隆載體直接用于連接，目的基因擴增片段經PCR產物純化試劑盒清洗之后用于連接。回收后的目的基因片段和線性載體的濃度用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀測定后，用ClonExpress?II一步克隆試劑盒連接，連接產物轉化E.coliJM109，轉化液涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上37 ℃恒溫培養10～12 h，挑取轉化子用菌落PCR法鑒定并送杭州擎科梓熙生物技術有限公司測序，測序結果正確的即為陽性轉化子pP43NMK/nap-das2.3。

1.2.2 重組工程菌株的構建和驗證

將重組質粒pP43NMK/nap-das2.3通過化學轉化法[21-22]轉化B.subtilisWB800感受態細胞，轉化液涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養20 h左右，挑取轉化子，先用溶菌酶將細胞壁溶解后，再用菌落PCR法擴增重組質粒序列，PCR擴增引物及反應條件同上，產物經9 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小正確的PCR擴增產物送杭州擎科梓熙生物技術有限公司測序，測序結果正確的即為陽性重組工程菌株B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3。

1.2.3B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3的培養和NAP-Das2.3表達

挑取LB平板上的陽性轉化子，分別接種于裝有5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，于37 ℃、150 r/min培養24 h，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，收集上清液。在50 mL具塞三角反應瓶中加入100 mmol/LN-乙酰-草銨膦的磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L，pH 8.0)1 mL，4 mL磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L,pH 8.0)，于35 ℃、180 r/min水浴搖床培養0.2 mL發酵上清液，每隔5 min，取1 mL至已加入10 μL 6 mol/L HCl的1.5 mL EP管中終止反應,再加6 mol/L NaOH調回反應液pH，在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清反應液，過0.22 μm濾膜，以未加入酶液的平行樣為空白對照組。200 μL反應液與400 μL衍生化試劑在35 ℃反應5 min，再加入400 μL超純水至終體積為1 mL，經過0.22 μm孔徑的濾膜過濾后進行HPLC分析。35 ℃下每分鐘催化生成1 μmolL-草銨膦所需要的酶量定義為1個活力單位(U)。發酵上清液加入等體積2×還原型SDS，沸水浴10 min后，用SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達情況。

生物量(細胞干重，DCW)測定：將發酵液離心去上清后，經磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L,pH 8.0)洗滌2次后收集菌體，置于烘箱中，80 ℃烘至恒重。

1.2.4 搖瓶培養條件的優化

保持種子活化培養基及培養條件不變(LB培養基、37 ℃、150 r/min培養10～12 h)，對發酵培養基的成分及產酶條件進行考察，進行單因子搖瓶優化實驗，主要包括：不同碳氮源種類及濃度、磷酸鹽、金屬離子、初始培養基pH、培養溫度對重組脫乙酰基酶的產酶情況及菌體生長的影響。

1.2.5 5 L發酵罐中菌體生長及產酶情況

搖瓶發酵最優條件確定后，在5 L發酵罐進行擴大，種子液接種量2%(V/V)，優化后的液體培養基3 L，培養溫度37 ℃，攪拌轉速200 r/min，通氣量0.5 VVM，自然pH，連接pH電極及溶氧(DO)電極，每隔2.5 h取樣測定發酵液pH、菌體濃度和酶活力等參數。

1.3 分析方法

L-草銨膦的檢測：SinoPak-C18(4.6 mm×200 mm，5 μm，伊力特)色譜柱；高效液相色譜儀Dionex UltiMate 3 000；V(甲醇)∶V(0.05 mol/L乙酸銨溶液)=10∶90(pH 5.7)，流速1.0 mL/min；檢測波長350 nm，發射波長450 nm；柱溫35 ℃，進樣體積10 μL。

衍生化試劑的配制：分別準確稱取0.1 g鄰苯二甲醛和0.12 gN-乙酰基-L-半胱氨酸，用10 mL無水乙醇充分溶解，隨后用硼酸緩沖液(pH 9.8)定容至終體積50 mL，置于冰箱中4 ℃避光保存。

2 結果與分析

2.1 脫乙酰基酶基因的獲得及其重組表達載體的構建和鑒定

2.1.1 線性化擴增載體及目的基因片段的克隆

經分別帶有載體末端序列的引物F1/R1及帶有目的基因末端序列的引物F2/R2擴增后，得到8 000 bp線性化載體和1 299 bp目的片段。

2.1.2 重組質粒pP43NMK/nap-das2.3構建和鑒定

目的基因擴增產物經Clean up清洗試劑盒純化后與線性化載體擴增產物經測量濃度后，計算用量，在一步克隆試劑盒反應體系中，相互連接，并轉化E.coliJM109，技術路線見圖2。菌落PCR呈陽性的轉化子提取質粒送至杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行DNA測序。連接產物序列正確的菌株提取質粒待用。

圖2 重組質粒pP43NMK/nap-das2.3的構建過程Fig.2 Construction of the recombinant plasmid pP43NMK/nap-das2.3

2.2 重組菌株的構建和菌落PCR鑒定

將重組質粒轉化到B.subtilisWB800感受態中，轉化液涂布于50 μg/mL卡那霉素LB平板，隨機挑取單菌落提取質粒，以F2/R2為引物進行PCR驗證。菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在8 000～12 000 bp之間有明亮的特異性條帶，與預期的陽性轉化子質粒大小吻合。

2.3 重組菌株的SDS-PAGE分析

挑取4個陽性轉化子接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基，37 ℃、150 r/min培養30 h，培養液經9 000 r/min，4 ℃離心10 min，離心收集上清液。將全細胞培養液及離心上清液進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白質表達情況，結果見圖3。根據氨基酸序列推算出NAP-Das2.3理論分子量是48.5 kDa。全細胞培養液和離心上清液，均出現了分子量約50 kDa的蛋白質條帶，與預期的目的蛋白質大小相符，證明重組NAP-Das2.3的枯草芽孢桿菌表達系統構建成功，NAP-Das2.3成功表達。

M1,M2-marker；1,2-B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3發酵液；3,4-發酵上清液圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of the culture broth and supernatant of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.4 重組菌的酶活力的測定

經檢測，重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3能夠可溶性表達NAP-Das2.3，但活力較低，發酵上清液中脫乙酰基酶活力為0.25 U/L。由于NAP-Das2.3搖瓶發酵表達量及酶活較低，進一步對菌體培養及產酶條件進行優化以提高表達量。

2.5 重組菌搖瓶發酵條件的優化

2.5.1 碳源對菌體生長及產酶的影響

考察了不同有機碳源(葡萄糖、糊精、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、D-果糖)和最優碳源質量濃度對重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3菌體生長及產酶的影響。由圖4-a可知，甘油和乳糖促進細胞產酶，發酵液中NAP-Das2.3的相對酶活分別為18.68和18.45 U/L，與對照組(不添加碳源，比酶活為15.21 U/L)相比，酶活分別提高了22.81%和21.32%，因此選擇甘油作為最優碳源。這與CHOU等[23]報道的添加甘油有利于降低包涵體并提高E.coli周質青霉素G酰化酶表達量一致。

雖然D-果糖、葡萄糖、糊精對菌體生長的促進作用較大，但添加可溶性淀粉、D-果糖、山梨醇、麥芽糖、糊精和蔗糖不利于NAP-Das2.3的表達。由圖4-b可知，當甘油質量濃度為6 g/L時，發酵液中的NAP-Das2.3酶活達最高，為28.53 U/L，繼續增加甘油，生物量有所增大，但對NAP-Das2.3表達有抑制作用。故選擇甘油的濃度為6 g/L作為菌株后續優化培養的碳源濃度。

圖4 碳源對B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產酶的影響Fig.4 Effect of carbon sources on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.2 氮源對菌體生長及產酶的影響

考察了14種有機氮源及其組合(豆粕、酵母膏、玉米粉、牛肉膏、花生粉、黃豆餅粉、蛋白胨、酵母浸出汁、酵母提取物、麩皮、麥芽浸汁、牛肉膏和蛋白胨、牛肉膏和酵母粉、蛋白胨和酵母粉)和無機氮源((NH4)2SO4、NH4H2PO4、NH4Cl、CH3COONH4、HCOONH4、NaNO2、NaNO3、尿素)以及最適氮源質量濃度對重組菌生長和產酶的影響。由圖5-a可知，10 g/L牛肉膏、麥芽浸汁、黃豆餅粉、玉米粉添加后，NAP-Das2.3活力均有顯著提高。而且添加10 g/L牛肉膏和麥芽浸膏后，發酵液中分泌的粗酶液酶活與對照組相比分別提高了123.23%和115.07%。但組合氮源對重組菌產酶影響不顯著，花生粉、豆粕、麩皮的加入反而抑制產酶。

圖5 氮源對B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3菌體生長和產酶的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

相比有機氮源，所測試的所有無機氮源都不利于菌體生長，對外源蛋白表達沒有顯著促進作用，并且添加(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COONH4、NaNO2、HCOONH4、尿素等無機氮源不利于NAP-Das2.3的表達，結果如圖5-b。當牛肉膏以30 g/L(質量濃度)添加時，菌體生長及蛋白表達量均達最高值，為2.75 DCW g/L和63.22 U/L，結果如圖5-c所示。

2.5.3 磷酸鹽對菌體生長和產酶的影響

在上述優化后的碳源和氮源的基礎上，進一步考察了NH4H2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4五種磷酸鹽對菌體生長和產酶的影響，磷酸鹽的總添加量為10.0 g/L。由圖6所示，測試的磷酸鹽對產酶沒有顯著促進作用，而且NaH2PO4對重組菌產酶還有抑制，所以培養基中不需要額外添加磷酸鹽。

圖6 不同磷酸鹽對B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產酶的影響Fig.6 Effect of phosphorus sources on growth and NAP- Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.4 金屬離子對菌體生長和產酶的影響

考察了13種金屬離子(Co2+、Mg2+、Fe2+、Ni2+、Ba2+、Li+、Zn2+、Mn2+、Sn2+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Cu+)的氯化鹽(2 mmol/L)和表面活性劑EDTA對菌體生長和產酶的影響。如表1所示，金屬離子Fe2+、Li+、Ca2+、Cu+、Cu2+等加入均抑制菌體生長，對菌體有顯著毒害，其中EDTA對菌體抑制相對較小，但所有金屬離子對產酶沒有顯著影響(86.88%～107.10%)，所以培養基中不需要添加金屬離子及EDTA。

2.5.5 初始培養基pH對菌體生長和產酶的影響

如圖7所示，研究了發酵培養基的初始pH(pH 5.0～9.5)對B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3的生長及產酶的影響。初始pH對菌體生長沒有顯著影響，但對菌株產酶影響較為明顯。當pH<6.5時，重組酶活力較低，初始pH在6.5～8.0，NAP-Das2.3活力較高，在pH 7.5時菌株的酶活力達到最高，為68.21 U/L。pH繼續增大時，酶活力下降趨勢明顯，因此選擇pH 7.5作為培養該菌株時的培養基初始pH。

表1 不同金屬離子及EDTA對B.subtilis WB800/ pP43NMK/nap-das2.3生長及產酶的影響Table 1 Effect of different metal ions and EDTA on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/ pP43NMK/nap-das2.3

圖7 初始pH對B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.6 培養溫度對菌體生長及產酶的影響

在最適碳氮源及其最適濃度，以及最適培養初始pH條件下，進一步研究了培養溫度對菌體生長和NAP-Das2.3酶活力的影響。選擇20、25、28、30、35、37、40、45 ℃進行考察，結果如圖8所示，溫度低于25 ℃時，不利于菌株的生長和NAP-Das2.3的表達，溫度在28～37 ℃范圍內，菌體生長良好且酶活力隨著溫度的升高而大幅度增大，菌株在37 ℃條件下生長狀態最佳，且此時酶活力最高，發酵液中酶活力達106.42 U/L。溫度進一步升高，酶活及菌體濃度降低，因此選擇培養溫度為37 ℃進行菌體培養及發酵產酶。

圖8 培養溫度對B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長和產酶的影響Fig.8 Effect of temperature on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.6 5 L發酵罐中重組菌的生長及產酶情況

將保藏的B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3活化后接種500 mL搖瓶，37 ℃培養12 h作為發酵種子液，以2%接種量轉接至3 L優化后的液體培養基中發酵培養，37 ℃，200 r/min，通氣量為0.5 VVM，自然pH，用pH電極及溶氧(DO)電極檢測發酵液的pH和溶氧，定時取樣測定發酵液的pH、菌體濃度并測定酶活力等參數,結果如圖9所示。

圖9 5 L發酵罐中B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3的生長和產酶曲線Fig.9 Time course of cell growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3 in 5 L bioreactor

在菌體培養過程中，培養體系pH隨培養時間的增加先略微下降再逐漸升高，這可能因為在前期菌體生長過快，導致溶氧不足發生厭氧呼吸產生酸導致pH下降，后期隨著氮源的利用，釋放出氨及菌體自溶導致pH上升。發酵菌體生長在22.5 h后開始穩定產酶，此時菌體生長處在穩定中后期，說明NAP-Das2.3主要是在穩定中后期完成加工成熟。培養至25 h時，酶活力達到最大116.13 U/L并穩定不變，而生物量在培養至27.5 h時達最大5.63 g/L，之后菌株進入衰亡期開始裂解，生物量和比酶活開始下降。

目前，利用基因工程手段對脫酰基酶進行異源重組表達的報道較多。如舒群峰等[24]將黏質沙雷氏菌SerratiamarcescensY213來源的SmargE基因編碼的N-乙酰鳥氨酸脫乙酰基酶在L-鳥氨酸生產菌株CorynebacteriumcrenatumSYPO-1中過量表達，顯著提高了酶活力，重組菌在5 L發酵罐中發酵96 h，L-鳥氨酸產量較出發菌株提高了33.2%，但該酶是在細胞內表達，對脫乙酰基酶催化的脫乙酰基反應而言，胞外可溶性表達可以減少酶的分離純化步驟，有利于酶的固定化等，使用酶蛋白進行催化也可以減少副產物的形成。WANG等[25]將來自Aspergillusnidulans的幾丁質脫乙酰基酶基因異源表達于EscherichiacoliBL21，經誘導后的酶活為4.17 U/mg，但是該酶以包涵體形式表達。而本研究利用枯草芽孢桿菌表達系統實現了脫乙酰基酶NAP-Das2.3的分泌型可溶性表達，這與KANG等[26]將來自Colletotrichumlindemuthianum的幾丁質脫乙酰基酶基在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115中異源分泌表達一樣，有助于脫乙酰基酶的純化、固定化及應用。

3 結論

本文將具有立體選擇性的脫乙酰基酶基因克隆至枯草芽孢桿菌受體細胞中，構建了重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3，并成功實現胞外分泌。進一步對重組菌培養及發酵產酶條件進行了優化，在此條件下，重組蛋白的表達水平由最初的0.25 U/L提高至106.42 U/L，優化后酶活提高了424.68倍。在5 L發酵罐中用優化的培養基培養30 h后，NAP-Das2.3活力達到116.13 U/L，較初始條件，酶活提高了463.52倍。

本研究構建了能夠可溶性表達草銨膦特異性脫乙酰基酶的基因工程菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3，一定程度上解決了脫乙酰基酶高效異源表達形成包涵體及表達量低的問題，且能直接組成型分泌表達脫乙酰基酶于發酵液中，為重組酶的分離純化帶來便利。綜上所述，本研究實現了重組脫乙酰基酶的高效可溶性表達，為其在L-草銨膦合成應用中提供了基礎，也為其他脫乙酰基酶的開發提供了借鑒。