低聚糖在瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌冷凍干燥過程中的保護作用

黃蓉，周子文，莫喬雅，董明盛，芮昕，張秋勤，陳曉紅，李偉

(南京農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)

乳品發(fā)酵劑(culture starter)是一種能夠促進乳的酸化過程，含有高濃度乳酸菌的特定微生物培養(yǎng)物。它是用于制造干酪、奶油及發(fā)酵乳制品所用的特定微生物培養(yǎng)材料[1-3]。乳酸菌菌體細胞和培養(yǎng)基分離是乳產(chǎn)品發(fā)酵劑生產(chǎn)過程中的一個重要環(huán)節(jié)，常用的方法有離心分離和超濾分離。離心分離具有方法簡單、處理量大、容易操作等優(yōu)點，是目前工業(yè)上菌體濃縮分離的首選方法。但在離心過程中，菌體不僅受到間隙操作中的氧損傷，還受到剪切力的作用而被拉長，從而導致細胞膜的滲透性和抗凍能力下降，因此在實際操作中常通過添加一定量的離心保護劑對乳酸菌菌體進行保護[4-6]。

冷凍干燥(即凍干)是在真空條件下進行的使凍結(jié)物料中的固態(tài)水升華從而被除去的一種高效干燥方法，乳酸菌菌體細胞經(jīng)離心分離后，與凍干保護介質(zhì)混合，經(jīng)冷凍干燥后可獲得凍干發(fā)酵劑，因此其常用于乳品發(fā)酵劑的工業(yè)化制備。冷凍干燥可以減少菌體細胞在干燥過程中蛋白質(zhì)失活的可能性，能夠較好保持細胞原有的構(gòu)架。干燥后發(fā)酵劑呈疏松多孔狀，與水接觸后能夠快速溶解恢復原來的性狀[7-11]。影響凍干過程中發(fā)酵劑存活率的主要因素有凍干保護介質(zhì)、凍結(jié)速度和凍結(jié)溫度等。選用合理的保護措施可以有效地減少菌體在冷凍干燥過程中的損傷和失活，影響乳酸菌凍干效果最突出的就是凍干保護劑。其不僅有利于提高菌體在冷凍干燥過程中存活率，還會影響保藏期間發(fā)酵劑的穩(wěn)定性[12-14]。

按分子大小，離心和凍干保護劑可分為小分子化合物(如低聚糖、醇、緩沖鹽、氨基酸、維生素)和大分子化合物(如蛋白質(zhì)、多肽、多糖)[15-16]。小分子保護劑(主要是糖類)由于氫鍵的作用具有很強的親水性，可以與菌體細胞膜磷脂中的磷酸基團或菌體蛋白質(zhì)極性基團形成氫鍵，既能降低磷脂的轉(zhuǎn)變溫度，也可使磷脂膜之間不致于產(chǎn)生折疊黏連，從而保護菌體細胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整性[17-18]。低聚半乳糖和低聚果糖同屬于功能性低聚糖，功能性低聚糖作為被廣泛認可的益菌因子在真空冷凍干燥中發(fā)揮著雙重作用，既能使得益生菌維持較高的成活率，也能發(fā)揮促進益生菌生長的作用[19]。由于不同的乳酸菌所適用的保護劑不盡相同，因此需要根據(jù)菌體的自身特點篩選出適合的保護劑系統(tǒng)。本文在對分離自新疆傳統(tǒng)食品賽里木酸奶中高產(chǎn)黏瑞士乳桿菌MB2-1(LactobacillushelveticusMB2-1)和嗜熱鏈球菌MB5-1(StreptococcusthermophilusMB5-1)發(fā)酵特性分析的基礎(chǔ)上，通過測定離心和冷凍干燥后菌體的存活率，考察了低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)和低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)在菌體冷凍干燥過程中的保護作用，這對乳品發(fā)酵劑的生產(chǎn)及菌種的離心分離和凍干保存均具有一定的理論與實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

LactobacillushelveticusMB2-1、StreptococcusthermophilusMB5-1為本實驗室從新疆拜城縣傳統(tǒng)賽里木酸奶分離和保存，經(jīng)多次傳代遺傳性狀穩(wěn)定[20-21]。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

QHT-90 FOS(純度≥90%)、QHT-600 GOS(純度≥60%),廣東江門量子高科生物股份有限公司；低蛋白乳清粉,法國LACTALIS公司；其他，國產(chǎn)分析純。

80和120 g/L的低蛋白乳清培養(yǎng)基，108 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基[22](g/L)：蛋白胨 10.0，牛肉膏 10.0，酵母膏 5.0，葡萄糖 20.0，吐溫80 1.0 mL，無水乙酸鈉 5.0，檸檬酸三銨 2.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，蒸餾水 1 L，瓊脂1.5%～2%，pH 6.2～6.6,121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；Avanti J-E冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；AIPHAPPHOT-2 YS2光學顯微鏡，日本Nikon公司；722可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；Heto PowerDry LL3000冷凍干燥機，美國Thermo公司；pH計，德國Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及發(fā)酵液制備

分別將L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1從甘油管中按4%(體積分數(shù))進行接種，在37 ℃條件下活化培養(yǎng)12 h，活化2次，培養(yǎng)基使用120 g/L的低蛋白乳清培養(yǎng)基；之后按3%(體積分數(shù))的接種量接種到80 g/L低蛋白乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分別于0、4、8、12、24、48 h取樣測定活菌數(shù)、pH值、滴定酸度、殘?zhí)橇亢途w密度(OD600)數(shù)值。

1.2.2 菌落平板計數(shù)

用滅菌后的生理鹽水將菌液逐級稀釋，對最后3個稀釋度進行平板計數(shù)，每個稀釋度計數(shù)2次。吸取1 mL菌液于滅菌平板中，再傾注冷卻至45～50 ℃的MRS固體培養(yǎng)基。最后將平板置于37 ℃培養(yǎng)48 h，進行菌落計數(shù)。

1.2.3 細胞數(shù)量測定

在波長為600 nm條件下，用質(zhì)量濃度80 g/L低蛋白乳清培養(yǎng)基調(diào)零，測量樣液的吸光度。

1.2.4 pH值測定

將pH計的電極球泡完全浸入樣液，讀取示數(shù)。

1.2.5 滴定酸度測量

將樣液稀釋50倍，加入3～4滴酚酞，用0.05 mol/L的NaOH標準溶液標定至微紅色，并在30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗的NaOH標準滴定溶液毫升數(shù)。

1.2.6 殘?zhí)橇繙y量

調(diào)節(jié)分光光度計波長至490 nm，預熱30 min。將樣液稀釋100倍，在試管中按次序加入0.5 mL水、0.5 mL稀釋樣液、0.5 mL 6%苯酚、2.5 mL濃硫酸，另取1只試管做空白對照。

1.2.7 測定離心條件下低聚糖對菌體的保護作用

1.2.7.1 離心保護劑溶液的配制

分別將10、20、30 g的QHT-90 FOS、QHT-600 GOS和葡萄糖溶于100 mL的蒸餾水中,制成質(zhì)量濃度分別為100、200、300 g/L的FOS、GOS和葡萄糖溶液，均在 115 ℃下滅菌15 min待用。

1.2.7.2 離心存活率的測定[15]

將L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1在80 g/L的低蛋白乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵12 h后，取10 mL于50 mL離心管中，分別加入40 mL 100、200和300 g/L的FOS和GOS溶液，對照組加入40 mL的生理鹽水，混合均勻，以4 000×g離心10 min后棄去上清液，各洗滌3次，用生理鹽水復溶至10 mL，進行菌落計數(shù)。實驗重復3次。

離心存活率的測定如公式(1)所示：

(1)

1.2.8 測定凍干條件下低聚糖對菌體的保護作用

1.2.8.1 凍干保護劑溶液的配制

配制方法同1.2.7.1。

1.2.8.2 凍干存活率測定[15]

將L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1在8%的低蛋白乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵12 h后，取10 mL于50 mL的離心管中，分別加入40 mL 100、200和300 g/L的FOS和GOS溶液，對照組加入40 mL的生理鹽水，混合均勻，以4 000×g離心10 min后棄去上清液，再分別加入40 mL相同溶液進行復溶，放入冰柜中預凍8 h，置于凍干機內(nèi)凍干48 h，再將其復溶至10 mL，進行菌落計數(shù)。實驗重復3次。

凍干存活率的測定如公式(2)所示：

(2)

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件作圖，SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.helveticus MB2-1和S.thermophilus MB5-1發(fā)酵特性分析

由圖1可知，在8 h時L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1生長緩慢，活菌數(shù)只有0.14×108CFU/mL和0.21×108CFU/mL，在12 h時活菌數(shù)同時達到最大值，分別為8.01×108CFU/mL和7.10×108CFU/mL，24 h后進入衰亡期，在48 h時2種菌的活菌數(shù)分別為1.61×108CFU/mL和2.30×108CFU/mL；OD600值在12 h前增長較快，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的OD600值分別從初始時的0.03和0.04增加至12 h時的1.89和1.03，之后緩慢增加，在發(fā)酵結(jié)束時分別為2.08和1.23；發(fā)酵液的pH值和滴定酸度呈現(xiàn)相反的變化趨勢，在8 h前接種L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的發(fā)酵液pH值分別從初始時的6.02和6.00急速下降到4.57和4.62，8 h后pH的變化趨勢逐漸趨于平緩。而接種L.helveticusMB2-1的發(fā)酵液的滴定酸度從0 h的22.50 °T迅速增加到了8 h的最大值，為122.30 °T，接種S.thermophilusMB5-1的發(fā)酵液的滴定酸度則從0 h的20.80 °T迅速增加到了24 h的最大值，為98.20 °T。和LI等[21]使用巴氏滅菌鮮奶培養(yǎng)基相比，發(fā)酵過程中pH值和滴定酸度的變化趨勢相似，但在鮮奶培養(yǎng)基中，pH值于12 h后才逐漸趨于平緩，最低pH值均比低蛋白乳清培養(yǎng)基中低(pH<4)。對于2種乳酸菌，在整個發(fā)酵時間內(nèi)殘?zhí)橇慷汲尸F(xiàn)下降趨勢，在24 h前，殘?zhí)橇繙p少速度較快，24 h以后變化趨勢逐漸趨于平緩，最終在48 h時L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的殘?zhí)橇恐挥?.60 g/L和5.30 g/L，說明在整個發(fā)酵過程中有80%的碳源被充分利用。以上結(jié)果表明L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1兩種乳酸菌均具有較好的底物利用能力和生長情況，可以進一步作為乳品等產(chǎn)品的菌種發(fā)酵劑來源。

2.2 不同種類和濃度的低聚糖對菌體離心的保護作用

將發(fā)酵12 h的L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1于4 000×g的轉(zhuǎn)速下離心，用不同濃度的GOS、FOS和葡萄糖溶液洗滌3次，空白對照組用生理鹽水進行洗滌，利用平板計數(shù)法測定菌落數(shù)，結(jié)果如圖2所示。在加入低聚糖保護劑之后，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的活菌數(shù)均與空白樣(生理鹽水清洗)有顯著性差異(P<0.05)，即所選低聚糖保護劑對2種乳酸菌均有一定的保護作用，而葡萄糖組對菌體的保護作用不顯著。在同樣濃度條件下，F(xiàn)OS對乳酸菌的保護作用要優(yōu)于GOS，且FOS的濃度越高，保護作用越強。在FOS質(zhì)量濃度分別為200、300 g/L時，L.helveticusMB2-1的活菌數(shù)分別為5.67×108CFU/mL和5.88×108CFU/mL。因此，選用GOS和FOS作為L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的離心保護劑較葡萄糖具有顯著優(yōu)勢，在同濃度下可優(yōu)先選擇FOS作為L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的離心保護劑。

圖2 不同濃度的GOS和FOS對菌體離心后活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of GOS and FOS on the viable cell counts after centrifugation注：小寫字母表示S.thermophilus MB5-1顯著性差異(P<0.05)；大寫字母表示L.helveticus MB2-1的顯著性差異(P<0.05)。下同。

L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的菌體存活率見圖3。

圖3 不同濃度的GOS和FOS對菌體離心后存活率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of GOS and FOS on survival rate after centrifugation

結(jié)果表明，不同濃度葡萄糖作為保護劑時，對L.helveticusMB2-1離心保護作用差異不顯著，菌體的存活率最高為18.73%，以低濃度(100 g/L)GOS和FOS作為保護劑，對菌體的保護作用較低，GOS作用下2株菌存活率分別為38.59%和14.38%，F(xiàn)OS作用下分別為26.62%和14.25%，而提高GOS和FOS濃度，對菌體的保護率也相應提高，GOS和FOS質(zhì)量濃度300 g/L時，L.helveticusMB2-1存活率分別達到68.03%和82.82%；GOS和FOS在相同濃度條件下對S.thermophilusMB5-1的保護作用要低于L.helveticusMB2-1，在質(zhì)量濃度300 g/L時，菌體存活率分別為34.25%和46.00%，對于2種乳酸菌，相同高濃度(200和300 g/L)條件下，F(xiàn)OS的保護效果均優(yōu)于GOS。這說明對于不同類型的乳酸菌，低聚糖的保護作用具有較大差異，在實際生產(chǎn)應用中應根據(jù)不同菌種的特性選擇最優(yōu)的凍干保護劑以達到最理想效果。

2.3 不同種類和濃度的低聚糖對菌體凍干的保護作用

如圖4所示,與對離心作用的保護作用相似，在加入低聚糖凍干后，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的活菌數(shù)均與空白樣有顯著性差異(P<0.05)，表明2種低聚糖對2種乳酸菌均有一定的保護作用，而葡萄糖組對菌體的保護作用較差，在同樣濃度條件下,GOS對2種乳酸菌的保護作用要優(yōu)于FOS，且隨著GOS濃度的增加，對乳酸菌的保護作用逐漸增強。從圖4中可知，在GOS質(zhì)量濃度分別為200和300 g/L時，L.helveticusMB2-1的活菌數(shù)分別為4.29×108和5.53×108CFU/mL，而在此濃度下，S.thermophilusMB5-1的活菌數(shù)分別為2.56×108和2.90×108CFU/mL。

圖4 不同濃度的GOS和FOS對菌體凍干后活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of different concentrations of GOS and FOS on the viable cell counts after freeze drying

GOS和FOS作為凍干保護劑，L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的菌體存活率如圖5所示。高濃度的低聚糖保護作用總體優(yōu)于低濃度低聚糖；凍干條件下，GOS作為保護劑，菌體存活率要明顯高于同濃度的FOS，對于L.helveticusMB2-1的保護作用也要優(yōu)于S.thermophilusMB5-1，在質(zhì)量濃度100 g/L GOS存在的條件下，L.helveticusMB2-1的菌體存活率為46.48%，而在質(zhì)量濃度300 g/L GOS條件下，L.helveticusMB2-1的菌體存活率可達到77.89%。因此在實際應用時，需根據(jù)不同處理步驟、菌種以及生產(chǎn)需要來確定保護劑的選擇。考慮到實際生產(chǎn)的復雜性，可以開發(fā)高效復合保護劑[23]，以提高應用的便利性。關(guān)于低聚糖對生物分子的保護作用，目前主要有2種假說解釋低聚糖對生物分子的穩(wěn)定機制：第1種為“水替代”假說，該假說認為在生物體大分子物質(zhì)的周圍有一層水化層，該水化層是維持生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的必要條件，當生物大分子失去這種功能性的水膜時，低聚糖能在生物大分子的失水部位以氫鍵形式相連接，形成一層類似于水化層的保護膜以代替失去的水化層；而另一種稱為“玻璃態(tài)”假說，該理論認為通過低聚糖玻璃化轉(zhuǎn)變的趨勢，導致了無定形連續(xù)相的形成，在這種結(jié)構(gòu)中分子運動和分子變性反應非常微弱[24-26]。低聚糖在菌體凍干時的這種保護作用，為提高工業(yè)化制備發(fā)酵劑的存活率[27-28]提供了一種思路。

圖5 不同濃度的GOS和FOS對菌體凍干后存活率的影響Fig.5 Effect of different concentrations of GOS and FOS on the survival rate after freeze drying

3 結(jié)論

本研究對L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1的發(fā)酵特性進行了分析，同時考察了不同濃度的低聚糖對2種乳酸菌在離心和凍干條件下活菌數(shù)和存活率的影響，結(jié)果表明,L.helveticusMB2-1和S.thermophilusMB5-1兩種乳酸菌均具有較好的底物利用能力和生長情況，可以進一步作為乳品等產(chǎn)品的菌種發(fā)酵劑來源；對于2種乳酸菌，在對菌體離心的保護作用中，除100 g/L的低濃度之外，其余濃度下FOS的保護作用均優(yōu)于GOS，而對菌體凍干的保護作用中，GOS的保護作用均優(yōu)于FOS，這說明不同種類低聚糖發(fā)揮最優(yōu)保護作用的操作步驟有所不同。2種低聚糖對L.helveticusMB2-1的保護作用均優(yōu)于S.thermophilusMB5-1，說明對于不同類型的乳酸菌，低聚糖的保護作用具有較大的差異。本實驗為今后更深入地研究低聚糖結(jié)構(gòu)與乳酸菌抗逆境的關(guān)系提供了參考，同時也為低聚糖作為保護劑在乳酸菌發(fā)酵劑的應用奠定了良好的基礎(chǔ)。