皺紋盤(pán)鮑腹足抗氧化肽的制備及其工藝優(yōu)化

顏琳，姜雙雙，閆欣，姚艷艷，常麗榮*，李長(zhǎng)青

1(國(guó)家海產(chǎn)貝類(lèi)工程技術(shù)研究中心，山東 榮成，264300)2(威海長(zhǎng)青海洋科技股份有限公司，山東 榮成，264300)

皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushanai)主要出產(chǎn)于我國(guó)山東半島和遼東半島，是我國(guó)北方地區(qū)著名的海珍品主要養(yǎng)殖品種之一[1]。皺紋盤(pán)鮑在所有鮑品種中，雖然其個(gè)體為中等大小，但由于皺紋盤(pán)鮑腹足處的肌肉鮮嫩，肉質(zhì)口感極佳，深受消費(fèi)者歡迎。目前，我國(guó)的皺紋盤(pán)鮑主要產(chǎn)業(yè)利用方向集中在生鮮及食品熱加工等領(lǐng)域，主要產(chǎn)品加工形式相對(duì)單一，例如生鮮鮑、冷凍鮑、干鮑、煮制風(fēng)味鮑、鮑罐頭，對(duì)于皺紋盤(pán)鮑肉質(zhì)資源的精深加工領(lǐng)域的研究極少。研究表明，皺紋盤(pán)鮑的腹足含有豐富的蛋白質(zhì)，其中，除含有少量膠原蛋白外，大部分為不易被人體消化吸收的大分子蛋白質(zhì)[2-3]。因此，如何高效地開(kāi)發(fā)利用皺紋盤(pán)鮑腹足的蛋白質(zhì)資源成為當(dāng)前亟待研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

本研究以成熟的皺紋盤(pán)鮑腹足為原料，利用蛋白酶酶解技術(shù)及響應(yīng)面法，設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解制備皺紋盤(pán)鮑抗氧化肽的最佳工藝，探索深加工途徑，為皺紋盤(pán)鮑腹足蛋白質(zhì)資源的高效精深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟的皺紋盤(pán)鮑腹足，威海長(zhǎng)青海洋科技股份有限公司提供。

酪蛋白、福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶，天津諾維信生物技術(shù)有限公司；NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.5 mol/L)、HCl標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.1 mol/L)，天津標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，華夏科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)、FeCl3、水楊酸、無(wú)水乙醇、維生素C、HCl、KOH、酒石酸鉀鈉、甲醛(36%)、NaOH、硼酸、H2SO4、CuSO4、K2SO4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pH計(jì)，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；UV2800SPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，蘇州江東精密儀器有限公司；電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；分析天平，上海梅特勒；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；索氏脂肪提取器，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備廠；臺(tái)式離心機(jī)，上海力康醫(yī)療器械有限公司；磁力攪拌器，寧波市群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；消化儀、凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；程控箱式電爐，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電爐，龍口市先科儀器有限公司。

1.3 皺紋盤(pán)鮑腹足營(yíng)養(yǎng)成分分析方法

總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：半微量凱氏定氮法；脂肪測(cè)定：索氏抽提法；灰分：炭化灼燒法；水分：恒溫干燥法。

1.4 酶解上清液的制備

選擇菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶為水解酶，以酶解上清液的水解度和還原力為評(píng)價(jià)指標(biāo)。從冰箱中取出皺紋盤(pán)鮑腹足，打漿處理后解凍混勻，稱取5 g原料加蒸餾水配制成500 mL溶液，并按上述4種酶制劑產(chǎn)品標(biāo)注的最適條件充分酶解后，100 ℃加熱滅酶，直至冷卻至室溫，4 000 r/min離心10 min，取離心后的酶解上清液備用[4-5]。

1.5 最佳用酶的篩選

1.5.1 多肽得率的測(cè)定[6]

1.5.2 水解度的測(cè)定

2)由液氮冷浸前后的掃描電鏡觀察可知，液氮對(duì)飽水煤樣的破壞程度遠(yuǎn)高于干燥煤樣，水結(jié)冰體積膨脹作用導(dǎo)致煤樣出現(xiàn)裂隙延伸、裂隙加寬等現(xiàn)象，使煤體滲透能力大幅度提高。

(1)酶解液中總氮含量的測(cè)定：GB 5009.5。

(2)酶解液中氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：GB 5009.235。

(3)水解度按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.5.3 還原力的測(cè)定[7]

取酶解上清液1.0 mL于洗凈干燥的離心管中，加入pH 6.6，1.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，然后加入1.0 mL的1%(體積分?jǐn)?shù))鐵氰化鉀溶液，搖勻后將離心管置于50 ℃的恒溫水浴鍋中加熱2 min，將K3Fe(CN)6還原為K4Fe(CN)6·3H2O。結(jié)束加熱之后，取出離心管立即制冷放涼，加入1.0 mL的10%(體積分?jǐn)?shù))TCA溶液，充分反應(yīng)之后，于4 000 r/min條件下離心5 min。取上清液2.0 mL，依次加入2.0 mL蒸餾水與0.8 mL的0.1%(體積分?jǐn)?shù))的FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min之后，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，其值即可表征產(chǎn)物的還原能力。Vc代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，所有反應(yīng)條件同上。并用蒸餾水作為空白調(diào)零。

1.5.4 DPPH·清除率的測(cè)定[7-8]

準(zhǔn)確稱取一定量DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品，用氯仿配制成2 mol/L溶液，然后用無(wú)水乙醇將其稀釋成0.1 mmol/L的DPPH·儲(chǔ)備溶液。分別按不同濃度吸取0.4 mL各酶解上清液，再加入0.4 mL的DPPH·儲(chǔ)備溶液，充分混勻后作為樣品組A；吸取不同濃度范圍的酶解上清液0.4 mL，再加入0.4 mL無(wú)水乙醇，充分混勻后作為對(duì)照組A1；吸取0.4 mL的蒸餾水，加入0.4 mL的DPPH·，混勻后作為空白組A0，然后在室溫條件下避光反應(yīng)，放置30 min，將反應(yīng)后的溶液置于離心機(jī)中，在8 000 r/min條件下離心10 min。取離心后的上清液在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。同時(shí)用Vc作為該實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照,如公式(2)所示：

(2)

1.6 酶解工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇主要因素為酶解時(shí)間、酶解溫度、pH，以DPPH·清除率為響應(yīng)值，分別對(duì)每個(gè)影響因素選取3個(gè)水平。按照曲面響應(yīng)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到多元二次回歸方程，并分析各因素產(chǎn)生的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，在一定的水平范圍內(nèi)求最佳值[9-11]。Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 皺紋盤(pán)鮑腹足營(yíng)養(yǎng)成分分析

皺紋盤(pán)鮑腹足的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表2。

表2 皺紋盤(pán)鮑腹足營(yíng)養(yǎng)成分 單位：%Table 2 Nutritional composition of abdomen of Haliotis discus

李蘋(píng)蘋(píng)[12]曾測(cè)定幾種貝類(lèi)的蛋白質(zhì)含量：櫛孔扇貝12.30%、文蛤10.70%、太平洋牡蠣9.83%和毛蚶8.20%；另外，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)論證雜色鮑、綠鮑、皺紋盤(pán)鮑腹足的蛋白質(zhì)含量分別為20.36%、21.63%、16.87%左右[13-14]。由表2可知，本實(shí)驗(yàn)中皺紋盤(pán)鮑腹足的蛋白含量測(cè)定結(jié)果為18.77%，相比之下，蛋白質(zhì)含量高于上述其他貝類(lèi)，且與上述研究中的其他品種鮑魚(yú)的蛋白質(zhì)含量大致相同。由此可見(jiàn)，皺紋盤(pán)鮑屬于高蛋白類(lèi)貝類(lèi)，是制備抗氧化肽酶解液的理想原料。

2.2 最佳蛋白酶的篩選

不同蛋白酶對(duì)鮑腹足的作用位點(diǎn)和作用環(huán)境不同，所獲得的多肽肽鏈長(zhǎng)短及性質(zhì)不同[15]，酶解相同的原料，會(huì)產(chǎn)生不同的短肽，因此對(duì)于酶解同一種原料而言，最優(yōu)蛋白酶的篩選成為本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.2.1 不同蛋白酶對(duì)水解度的影響

水解度即蛋白質(zhì)被水解的肽鍵數(shù)占蛋白質(zhì)水解的總肽鍵數(shù)的百分?jǐn)?shù)[16]。由圖1可知，中性蛋白酶和堿性蛋白酶在前3 h迅速酶解蛋白質(zhì)，水解度迅速升高。木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶在1 h內(nèi)迅速酶解蛋白質(zhì)，在1～2 h酶解速度放緩，2～3 h酶解蛋白質(zhì)速度又迅速升高，水解度也隨之迅速升高。在酶解6 h之后，4種蛋白酶酶解液的水解度逐漸趨于穩(wěn)定，說(shuō)明對(duì)皺紋盤(pán)鮑腹足蛋白質(zhì)的酶解反應(yīng)基本完成，此時(shí)，中性蛋白酶的水解度最高，達(dá)到20.11%，堿性蛋白酶水解度最低，為15.96%，菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解度分別為18.91%、16.95%。

圖1 不同蛋白酶對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of different proteases on degree of hydrolysis

2.2.2 不同蛋白酶對(duì)多肽得率的影響

多肽得率是不同蛋白酶對(duì)皺紋盤(pán)鮑腹足蛋白質(zhì)的酶解程度的象征性指標(biāo)，同時(shí)也是反映抗氧化肽酶解液中多肽含量的重要指標(biāo)之一[10,17]。酶解1 h內(nèi)，4種蛋白酶的多肽得率迅速增加，1 h后仍在逐漸增加直至趨于穩(wěn)定。文獻(xiàn)顯示，蛋白酶酶解產(chǎn)生的多肽會(huì)被進(jìn)一步分解成氨基酸[6]，酶解5 h后，菠蘿蛋白酶的多肽得率降低可能是上述原因所致。6 h后，中性蛋白酶的多肽得率持續(xù)升高，至8 h時(shí)，多肽得率達(dá)到最高，為72.16%，堿性蛋白酶的多肽得率最低，僅為55.93%(圖2)。

圖2 不同蛋白酶對(duì)多肽得率的影響Fig.2 Effect of different proteases on polypeptide yield

2.2.3 不同蛋白酶對(duì)還原力的影響

從圖3可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，還原力均不斷提高，說(shuō)明部分氨基酸和抗氧化肽的抗氧化活性較強(qiáng)[18]。酶解前4 h，隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的還原力逐漸提高，木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物還原力在酶解1 h后提升速率變緩：酶解4 h后，中性蛋白酶和堿性蛋白酶的升高速率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，中性蛋白酶酶解液在酶解7 h還原力達(dá)到最高，為0.589；堿性蛋白酶酶解液在酶解第6 h還原力達(dá)到最高，為0.578。由此可見(jiàn)，中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解液的還原力相差不大，但是堿性蛋白酶需要較高的酶解pH條件，考慮到工業(yè)成本選用中性蛋白酶(圖3)。

圖3 不同蛋白酶對(duì)還原力的影響Fig.3 Effect of different proteases on reducing capacity

2.2.4 不同抗氧化肽酶解液對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·清除率是研究蛋白酶水解產(chǎn)物的體外抗氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)[19]。如圖4所示，4種抗氧化肽酶解液對(duì)DPPH·清除作用各不相同，但對(duì)DPPH·的清除作用均很強(qiáng)，清除率一直保持在50%以上。中性蛋白酶酶解液的DPPH·清除率保持最高，5 h時(shí)達(dá)到最高，為95.63%；菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶均在酶解3 h時(shí)達(dá)到最高，分別為83.97%和89.63%；堿性蛋白酶在6 h時(shí)達(dá)到最高，為83.36%。

圖4 不同抗氧化肽酶解液對(duì)DPPH·的清除作用Fig.4 Clearance of DPPH· by different antioxidant peptidyl hydrolysate

綜合以上分析，中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解產(chǎn)生的抗氧化肽酶解液具有較高的水解度，中性蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)生的抗氧化肽酶解液具有較高的還原力，但中性蛋白酶酶解液對(duì)DPPH·的清除作用明顯優(yōu)于另外3種?？紤]成本，選擇中性蛋白酶。

2.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合預(yù)實(shí)驗(yàn)中單因素所得結(jié)果，以DPPH·清除率為響應(yīng)值，選取3個(gè)影響最大的因素：酶解時(shí)間、酶解溫度、pH，優(yōu)化中性蛋白酶酶解皺紋盤(pán)鮑腹足的工藝。Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments

運(yùn)用Design Expert軟件，對(duì)以上17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)響應(yīng)值進(jìn)行二次回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，得到以下多元回歸方程：

Y=93.83+0.45A+0.13B+3.39C-0.93AB+0.82AC+2.11BC-4.20A2-3.36B2-2.19C2

2.3.2 回歸模型的建立及分析

如表4回歸模型的各項(xiàng)方差分析結(jié)果所示，F(xiàn)檢驗(yàn)可以反映回歸方程的有效性，失擬檢驗(yàn)反映所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度即二者差異的程度，校正決定系數(shù)R2用來(lái)評(píng)價(jià)回歸方程的優(yōu)劣，變異系數(shù)反映數(shù)據(jù)離散程度的絕對(duì)值[20]。

表4 回歸模型顯著性分析Table 4 Analysis of significance with regression model

注：校正決定系數(shù)R2=0.957 0；*,在P<0.05水平上顯著。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，模型F值為17.31，P值<0.05，表明該二次方程模型顯著；失擬檢驗(yàn)P值>0.05，對(duì)模型是有利的，因此可以用該回歸方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。并且，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.957 0，這說(shuō)明該模型的擬合性較好。綜合對(duì)上述各參數(shù)的分析，表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠，各因素水平的區(qū)間設(shè)計(jì)合理，可以用來(lái)對(duì)皺紋盤(pán)鮑腹足抗氧化肽的制備工藝進(jìn)行初步分析和預(yù)測(cè)。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

圖5、圖6和圖7為回歸方程得出的AB、AC、BC之間交互作用的響應(yīng)面圖。

圖5 酶解時(shí)間與pH對(duì)DPPH·清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the effect of enzymatic hydrolysis time and pH on DPPH· clearance

圖6 酶解溫度與pH對(duì)DPPH·清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of the effects of enzymatic hydrolysis temperature and pH on DPPH· clearance

圖7 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)DPPH·清除率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of the effects of enzymatic hydrolysis time and hydrolysis temperature on DPPH· clearance

通過(guò)對(duì)回歸方程的求導(dǎo)計(jì)算極大值，得到了對(duì)應(yīng)的各主要因素分別為pH 7.10、酶解溫度50.25 ℃、酶解時(shí)間4.65 h。此條件下，抗氧化肽酶解液的DPPH·清除率的理論最高值為96.24%。

2.3.4 最優(yōu)酶解工藝條件的驗(yàn)證

采用上述優(yōu)化后得到的酶解工藝條件：pH 7.10、酶解溫度50.25℃、酶解時(shí)間4.65 h，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到DPPH·清除率分別為：96.07%、95.88%、96.41%，多肽含量分別為：81.17%、79.93%、80.59%，平均多肽含量為80.56%，平均DPPH·清除率為96.12%，與預(yù)測(cè)理論值相比，其相對(duì)誤差僅為0.12%，這說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后得出的該回歸方程對(duì)本實(shí)驗(yàn)具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

皺紋盤(pán)鮑腹足蛋白質(zhì)含量高達(dá)18.77%，是一種很好的蛋白質(zhì)利用資源。優(yōu)化得到皺紋盤(pán)鮑腹足抗氧化肽的酶解工藝為：pH 7.10、酶解溫度50.25 ℃、酶解時(shí)間4.65 h。驗(yàn)證顯示，實(shí)際值與預(yù)測(cè)理論值的相對(duì)誤差僅為0.12%，且平均多肽含量可達(dá)到80.56%，說(shuō)明在該工藝條件下制備出的抗氧化肽酶解液效果較好。本文所研究制備的皺紋盤(pán)鮑腹足抗氧化肽是以純天然的皺紋盤(pán)鮑腹足為原材料提取，與傳統(tǒng)人工合成的抗氧化劑相比較，其抗氧化性能更加穩(wěn)定、更加綠色環(huán)保，更容易被消費(fèi)者接受。同時(shí)，該研究也可為食品添加劑和化妝品產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的商業(yè)潛力，為促進(jìn)皺紋盤(pán)鮑腹足的精深加工和開(kāi)發(fā)提供有力的支持。