短乳桿菌發酵對紅棗汁品質的影響

余偲，趙育，張晶，陳悅，白莉圓，楊澤堃，張寶善,2*

1(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)2(陜西省果蔬深加工工程技術研究中心，陜西 西安，710119)3(西北大學 生命科學學院，陜西 西安，710069)

紅棗是中國的特色果品，具有較高的營養價值和藥用價值。據報道，每百克干棗中含糖類物質約60%以上、蛋白質1.2%、脂肪0.2%[1]，此外紅棗中還含有豐富的有機酸、氨基酸[2]、維生素、礦物質和微量元素[3]，以及大量的多糖[4]、總酚、總黃酮類化合物[5]、環磷酸腺苷[6]、皂甙等，具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖等的作用[1]，是一種藥食同源的食品。近年來棗樹作為國家脫貧致富的經濟林樹種，種植面積迅速擴大，產量迅速增加，僅新疆維吾爾自治區栽培面積就達40多萬公頃，致使紅棗價格急劇下降，每年均有大量的原料剩余，亟待擴大紅棗精深加工和利用[7]。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是天然存在活性成分、一種非蛋白組成的氨基酸，廣泛存在于動植物體內，具有重要的生理功能，如鎮靜、催眠，尤其對更年期的失眠、壓抑和自身失調療效良好[8]。如今，利用乳酸菌發酵生產高含量GABA的功能性飲料越來越受到消費者的青睞，使得開發富含天然營養的功能性飲料已成為研究的熱點之一，通過微生物發酵生產高含量GABA的研究越來越多，KANTACHOTE等[9]用植物乳桿菌發酵椰子汁，發酵后GABA含量為128 μg/mL，盧嘉懿等[10]的研究表明，經植物乳桿菌發酵后蘋果汁和梨汁中的GABA含量增加到0.11和0.14 mg/kg，左金磊[11]用霉菌生產GABA，通過優化得出GABA的產量為0.59 g/L。王振斌等[12]用葛根汁等經乳酸菌和酵母菌混合發酵，使GABA質量濃度從未發酵時的0.98 g/L增加到3.64 g/L，同比增加了279.17%。

雖利用果蔬汁發酵產GABA的研究在不斷增多，但用短乳桿菌發酵紅棗汁生產GABA及其對發酵過程中紅棗汁營養成分和抑菌特性的影響卻鮮有報道。本研究以紅棗汁為原料，利用短乳桿菌進行液態發酵，對發酵期間紅棗汁中GABA、有機酸等營養成分、抗氧化能力和抑菌能力進行分析，并探究紅棗汁在發酵過程中品質及營養成分的動態變化，通過短乳桿菌發酵紅棗汁產生功能性成分，可作膳食補充劑，開發一種純天然發酵的GABA飲品[13]，增加紅棗的附產品值。同時，本實驗的研究結果可為紅棗汁發酵飲料的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用干凈、無病蟲害、無霉變的新疆產干制駿棗；甲醇、乙腈均為色譜純，KH2PO4、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)、β-巰基乙醇、福林酚、L-谷氨酸、MRS培養基等試劑均為國產分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；GABA、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、富馬酸均為標準品，美國Sigma公司。

短乳桿菌：短乳桿菌(Lactobacillusbrevis,LB)YM1301。

1.2 儀器與設備

BSA224S型分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學股份有限公司；HWS智能恒溫恒濕培養箱，寧波江南儀器廠；Multiskan Go酶標儀，美國Thermo Electron公司；Ultimate3000型高效液相色譜儀，Thermo公司；HC-3018高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅棗汁的制備

將干紅棗清洗干凈，去核，按照m(紅棗)∶m(水)=1∶3加入純凈水，100 ℃預煮10 min，冷卻后用打漿機破碎，按質量比加入0.2 %的果膠酶，50 ℃下酶解3 h，用200目尼龍篩網過濾取汁，備用。

1.3.2 菌種的活化和培養

將試驗用的短乳桿菌在MRS固體培養基上進行涂布，放入恒溫培養箱，37 ℃條件下培養24 h，挑取固體培養基上的單菌落轉接到MRS液體培養基中，經過2次MRS液體培養基繼代培養進行擴培；將菌懸液轉移至無菌離心管中，用離心機在8 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，加入0.85%的無菌生理鹽水清洗2次，再用無菌生理鹽水懸浮后，調整菌懸液濃度為1×108CFU/mL，作為紅棗汁發酵備用菌種。

1.3.3 紅棗汁乳酸菌發酵飲料的制備

紅棗汁在105 ℃下殺菌10 min，冷卻至室溫后將短乳桿菌按8%的添加量接種到紅棗汁中，L-谷氨酸添加量為5 g/L[9]，在37 ℃培養箱中發酵72 h，每隔12 h取樣1次，通過測定GABA含量、pH值、酸度、有機酸含量、抗氧化活性、抗菌活性，分析發酵過程中紅棗汁品質的變化。

1.4 指標測定

1.4.1 高效液相色譜法測定GABA含量

HPLC色譜條件：色譜柱：C18柱；流動相A：甲醇；流動相B：V(四氫呋喃)∶V(甲醇)∶V(0.05 mol/L醋酸鈉(pH 6.2))=5∶75∶420；紫外檢測波長254 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min[14]。

衍生試劑的配制：稱取鄰苯二甲醛(OPA)10 mg先后加入10 μLβ-巰基乙醇和2.5 mL乙腈溶解、混勻，避光保存[15]。

0.4 mol/L硼酸緩沖液：稱取硼酸24.7 g加入1 L超純水溶解，調節pH值為10.4。

樣品測定：取離心后的紅棗發酵樣液100 μL，加入0.4 mol/L的硼酸緩沖液1 mL和OPA衍生液200 μL，混勻后，衍生化反應30 min，進行樣品測定，之后利用已建立的標準曲線計算得出發酵液中GABA的含量[16]。

標準曲線的建立：以GABA標準溶液濃度為橫坐標，高效液相色譜法測得的峰面積為縱坐標，建立標準曲線并得到回歸方程，即y=0.080 3x-2.072 8，相關系數R2=0.999 2。

1.4.2 理化指標的測定

總酸：酸堿滴定法[17](以乳酸計)；pH值：用pH計直接測定；還原糖：3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定，以葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，建立標準曲線并得到回歸方程，即y=0.628 7x-0.001 9，相關系數R2=0.999 1；總酚：采用福林酚法測定[18]，以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，建立標準曲線并得到回歸方程，即y=0.059x+0.061 5，相關系數R2=0.998 8。

1.4.3 有機酸的檢測

色譜條件：流動相：pH 2.7的0.04 mol/L KH2PO4，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，紫外檢測波長210 nm，進樣量20 μL[19]。

樣品測定：將紅棗發酵液在轉速8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用流動相稀釋10倍，之后用0.22 μm的有機濾膜過濾，濾液上機分析。

1.4.4 抗氧化檢測

(1)清除DPPH自由基能力

配制濃度為0.4 mmol/L的DPPH溶液，用95%無水乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中，配好后避光低溫保存備用[20]。

精確移取100 μL樣品于96孔板中，并加入100 μL新鮮配制的DPPH乙醇溶液，充分混勻，黑暗反應30 min，于波長517 nm處測定吸光值Ai，以無水乙醇溶液作參比。

空白組用100 μL無水乙醇代替DPPH溶液，測定吸光值Aj。

對照組用100 μL DPPH溶液與100 μL無水乙醇混合，測定吸光值Ac。清除率計算如公式(1)所示：

(1)

(2)清除ABTS+自由基能力

ABTS+工作液配制：將ABTS配成濃度為7.4 mmol/L的溶液，K2S2O8配成濃度為2.6 mmol/L的水溶液，各取1 mL等體積混合后，于室溫下避光12～16 h。用80%乙醇將溶液稀釋至40～50倍，在734 nm波長下測定吸光度，使其吸光值為0.7±0.02，即為配制好的ABTS工作液[21]。

精確移取100 μL樣品于96孔板中，再加入100 μL ABTS+工作液，振搖10 s，避光靜置6 min，于波長734 nm下測定吸光度A。

對照組用100 μL甲醇代替100 μL樣液，測定吸光值A0。計算如公式(2)所示：

(2)

1.4.5 抑菌性能的測定

取含量為106～107CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌3種指示菌各200 μL涂布于LB固體培養基表面，輕放上牛津杯，取200 μL離心后的樣液加入牛津杯中(n=3)，平穩輕移至37 ℃培養基培養24 h，十字交叉法測定抑菌圈直徑作為指標，測定產品的抑菌性能[22]。

抑菌效果判定標準：抑菌圈直徑可以反映各種抑菌液的抗氧化能力，通過比較不同發酵時間段培養基表面抑菌圈直徑大小，從而對乳酸發酵液的抗菌性作出較全面的評判。

1.5 數據統計與處理

本實驗利用Excel 2010和DPS 2005對試驗數據進行分析，實驗重復測定3次，結果用平均值±標準偏差表示。采用Duncan新復極差分析法，P<0.05為顯著相關，P<0.01為極顯著相關。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中GABA的變化

通過對紅棗汁中加入5 g/L的L-谷氨酸后接入短乳桿菌進行發酵，與直接用短乳桿菌發酵紅棗汁進行對比，探究隨著發酵時間的不同，發酵液中GABA的變化如圖1所示。

發酵時間對GABA有一定的影響。當紅棗汁未發酵時，GABA的含量為58.7 μg/mL，發酵時間在0～60 h時，未添加和添加5 g/L的L-谷氨酸中GABA含量隨著時間增加均呈現上升的趨勢，當發酵時間達到60 h時，添加L-谷氨酸的紅棗汁GABA產量達到最大值288.04 μg/mL，分析其原因可能是由于菌種被接入紅棗汁后快速繁殖，菌體數量快速增加，使得GABA含量呈現上升的趨勢；繼續增大發酵時間，GABA均呈現下降的趨勢，這可能是由于發酵后期紅棗汁中營養物質貧乏，一些菌體消耗了GABA，使得消耗量大于產生量，導致其含量下降[7]。

圖1 發酵過程中GABA的變化Fig.1 The change of the GABA during fermentation

發酵時間在48～60 h 2組GABA合成速度明顯變緩，當發酵時間為60 h時，未添加L-谷氨酸的紅棗汁GABA含量最高為142.17 μg/mL，相比于添加L-谷氨酸的紅棗汁中GABA含量明顯較低，這可能是由于短乳桿菌能夠通過谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸鹽脫羧合成GABA，使加入L-谷氨酸的紅棗汁中GABA含量提高。從該結果可以看出，通過乳酸菌的發酵作用能提高紅棗汁中GABA的含量，同時L-谷氨酸的添加對紅棗汁中GABA的產生具有顯著的促進作用。

2.2 發酵過程中總酸和pH值的變化

紅棗汁在發酵過程中總酸和pH值變化如圖2所示。從圖中可以看出隨著發酵時間不斷增加，總酸含量不斷上升，pH值不斷下降的趨勢，這是由于短乳桿菌消耗糖類物質代謝產生乳酸使酸度上升而產生的結果[23]，當發酵時間超過60 h時，總酸含量的增加和pH值的降低都趨于穩定，這是由于發酵液中積累大量的有機酸，低酸環境影響了短乳桿菌的生長和代謝使產酸能力受到影響[24]；發酵時間為72 h時，總酸的含量達到1.87 g/(100 mL)，此時pH值為3.39。

圖2 發酵過程中總酸含量和pH的變化Fig.2 Changes in total acids and pH during fermentation

2.3 發酵過程中總酚含量的變化

隨著菌種的發酵，紅棗汁中的總酚含量變化如圖3所示。

圖3 發酵過程中總酚含量的變化Fig.3 The change of total phenol content during fermentation注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

從圖3中可以看出，隨著發酵時間的增加，紅棗發酵液中總酚含量呈現先增加后降低的趨勢；發酵時間在0～36 h時，總酚含量呈現顯著的增加，這是由于經短乳桿菌發酵后，可溶性結合酚被釋放，使得總酚含量上升[25]。當發酵時間達到60 h時，總酚含量達到最大值，為292.07 mg/(100 mL)。隨著發酵時間的延長，總酚含量逐漸降低，其原因可能是在發酵后期酚類物質被微生物分解。

2.4 發酵過程中還原糖含量的變化

隨著菌種的發酵，紅棗汁中的還原糖含量變化如圖4所示。

圖4 發酵過程中還原糖含量的變化Fig.4 The change of reducing sugar content during fermentation

從圖4中可以看出，發酵時間在0～60 h，還原糖含量不斷下降，這是由于短乳桿菌不斷生長繁殖，還原糖被快速的消耗，使得發酵液中還原糖含量急劇下降[26]；60 h之后，紅棗汁中的還原糖含量沒有明顯的變化，基本保持穩定；未發酵時紅棗汁中還原糖含量13.54 g/(100 mL)，發酵至72 h時還原糖含量減少至 6.53 g/(100 mL)，消耗掉原紅棗汁中還原糖含量的51.77%。

2.5 發酵過程中有機酸的變化

從表1中可以看出，各有機酸與峰面積均呈現良好的線性關系，相關系數(R2)都大于0.991 9，采用外標法對各種有機酸進行定量分析[27]。通過高效液相色譜法測定紅棗汁發酵過程中有機酸含量變化的結果見表2和圖5。

表1 有機酸的標準曲線及保留時間Table 1 Organic acid standard curve and the retention time

圖5 有機酸混標的高效液相色譜圖Fig.5 Chromatogram of organic acids from a standard mixture

利用高效液相色譜法對紅棗汁發酵過程中的有機酸進行分析，從表2可以看出，紅棗汁中檢測出8種有機酸，發酵后檢測出9種，且發酵時間長短影響著發酵液中有機酸的含量。草酸是紅棗汁主要的有機酸之一，在初始紅棗汁中含量為182.17 mg/(100 g)，隨著發酵時間的延長，發酵至72 h，草酸含量下降至103.21 mg/(100 g)，這可能是因為其參與了風味物質的形成或轉化為乳酸[22]，使草酸隨著發酵的進行含量不斷的降低；發酵過程中乳酸含量從51.65 mg/(100 g)增加到1 718.91 mg/(100 g)，發酵前后含量極顯著的增加，這是由于乳酸作為乳酸菌發酵的主要產物，其變化基本符合乳酸菌生長代謝過程中產物合成機制[28]。

表2 不同發酵時間紅棗汁中有機酸的含量 單位：mg/(100 g)Table 2 Content of organic acid in jujube juice at different fermentation time

注：不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

酒石酸對于微生物發酵來說是一種含量相對穩定的酸，因此在發酵過程中變化較小[29]；檸檬酸在發酵前后也比較穩定，奎寧、蘋果酸、乙酸、富馬酸在發酵過程中先增加，后下降。其中奎寧在12 h時達到最大，蘋果酸在發酵36 h時達到最大，乙酸、富馬酸在發酵48 h時達到最大；分析其原因可能是在發酵過程中先產生此類有機酸，隨后這類有機酸作為營養物質被微生物利用和代謝使其含量下降。乙酸在發酵前48 h含量不斷的增加，隨后逐漸降低。這可能是由于被氧化分解成為CO2和H2O，以及揮發損失所致[29]。

2.6 發酵過程中抗氧化活性的變化

紅棗汁通過發酵得到具有較高總酚含量的發酵液，這會增加發酵液的抗氧化活性，通過對發酵液中抗氧化活性指標(ABTS清除能力、DPPH清除能力)的測定，從而判斷發酵液抗氧化活性成分的變化。通過ABTS、DPPH等方法對2種培養基上清液的抗氧化活性進行測定。從圖6可以看出，隨著發酵時間的增加，紅棗發酵液中的抗氧化活性也在增加，基于ABTS+自由基的清除能力在57.17%～81.61%，DPPH自由基清除能力在61.85%～83.08%；此外，2種發酵液對ABTS+和DPPH+清除力產生相同的趨勢，在0～60 h抗氧化活性不斷增強，這可能是由于在微生物的作用下，紅棗汁中的酚類物質發生了復雜的變化[30]，將一些結合酚類物質水解成游離酚，并且釋放大量的有機酸，防止酚類物質的降解，從而提高了清除ABTS和DPPH自由基的能力[31]。當發酵時間超過60 h之后，紅棗汁對ABTS和DPPH自由基的清除能力呈下降的趨勢，可能是由于在微生物作用下，紅棗汁中的酚類物質組分及其含量一直處于動態變化中所造成的現象[32]。結果表明，紅棗汁經短乳桿菌發酵后能使其抗氧化活性提高。

圖6 發酵過程中抗氧化活性的變化Fig.6 Changes in antioxidant activity during fermentation注：小寫字母不同表示ABTS+自由基清除率差異顯著；大寫字母不同表示DPPH+自由基差異顯著(P<0.05)。

2.7 發酵過程中發酵液抑菌活性的變化

紅棗汁發酵過程抑菌性能變化如圖7所示，當發酵時間在12 h之前，紅棗汁對這3種菌的生長抑菌效果不佳，其原因可能是由于短乳桿菌剛接入紅棗汁中，剛開始生長繁殖，酸度不高，同時發酵液中糖含量高和pH值偏高[22]，使得發酵液抑菌性較差；24 h之后，紅棗汁抑菌性能顯著的增加。同時可以看出，紅棗汁發酵液對3種菌抑菌順序依次為：大腸桿菌>鼠傷寒沙門氏菌>金黃色葡萄球菌，其中大腸桿菌對發酵液最為敏感，對其抑菌效果最好；隨著發酵時間的增加，發酵液對這3種菌的抑菌性呈現增大的趨勢，這可能是因為隨著短乳桿菌的不斷發酵，抑菌物質如乳酸、乙酸等不斷的積累，使得紅棗發酵液酸度降低[17]，同時產生細菌素、胞外多糖、小肽等，從而抑制或殺死更多的致病菌和腐敗菌，使紅棗汁抑菌性能顯著上升[33-34]，發酵液的抑菌性能有助于紅棗發酵液的保存，也在一定程度上保證了產品的飲用安全。

圖7 發酵過程中發酵液抑菌活性的變化Fig.7 The change of antibacterial activity of fermentation broth during fermentation

3 結論與討論

本研究以紅棗汁為原料，經短乳桿菌發酵后可制得含有GABA活性物質的乳酸菌飲料，若初始紅棗汁中添加L-谷氨酸，則最終發酵液中GABA含量更高。通過測定和分析發酵前后紅棗汁中營養成分、抗氧化能力及其抑菌特性的變化，發現短乳桿菌發酵紅棗汁的最佳發酵時間為60 h時，發酵后紅棗汁中GABA的含量從58.70 μg/mL增加到288.04 μg/mL；紅棗汁總酸含量從0.58 g/(100 mL)增加到1.84 g/(100 mL)，總酚含量從224.62 mg/(100 mL)增加到292.07 mg/(100 mL)，發酵后酸度和酚類物質顯著上升，賦予了紅棗汁更佳的口感；DPPH和ABTS自由基清除率也達到最大；與發酵前相比，紅棗發酵液的抑菌性能也有一定的增加。發酵液的抑菌性能跟酸的含量變化有一定的相關性，隨著酸度的增加，抑菌效果也在增強，與原紅棗汁相比能夠極大提高產品的貯藏穩定性，將有助于綠色健康產品的開發。

綜上所述，利用短乳桿菌發酵紅棗汁生產含GABA的功能性飲品，是一種經濟、安全的方法[35]，同時經過短乳桿菌發酵后，紅棗汁的品質和抑菌性能得到明顯地改善。以上結果為開發富含GABA的紅棗汁發酵飲品提供一定的理論依據。