工業蛋白水解酶快速檢測方法的建立與初步應用

宋鵬,程磊，田康明，王正祥*

1(天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津,300457)2(天津科技大學 化工與材料學院，天津,300457)

蛋白水解酶是水解蛋白質肽鏈的酶的總稱，是一類重要的工業酶制劑，在食品、發酵、醫藥、紡織和洗滌等工業中具有重要應用價值[1-7]。依據蛋白質水解后新生成的氨基和羧基的數量、肽鍵減少數或特定游離氨基酸生成量，蛋白水解酶活力的檢測方法主要有雙縮脲法(Biuret法)、福林法(Folin法)、茚三酮法、三硝基苯磺酸法(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol,TNBS法)和鄰苯二甲醛法(o-phthalaldehyde,OPA法)等[8]。我國現行有關蛋白酶酶活測定的國家和行業標準中，主要采用福林法[9-11]。此法的檢測原理是，依據蛋白質底物經水解后游離酪氨酸和色氨酸釋放量，定量蛋白酶的活力水平[12]。

蛋白水解酶是現今研究中最為復雜的水解酶系，成員眾多，水解方式迥異。通過上述原理建立起來的酶活檢測方法，存在明顯的局限性。例如，內肽酶是制備功能性寡肽的重要酶類，偏好水解遠離多肽鏈末端的內部肽鍵，通過上述酶活測定方法顯然無法滿足對其酶活的快速和靈敏檢測[12-16]。因為部分內肽酶水解蛋白質后，所釋放的新生氨基和羧基的數量、肽鍵減少數或特定游離氨基酸量都處于相對較低的水平，甚至不會釋放福林法檢測所依賴的酪氨酸和色氨酸。

1997年，JONES等采用氟硼熒熒光素標記酪蛋白，基于熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技術原理，建立了胃蛋白酶等活力的均相檢測方法，此法在無需對檢測產物進行分離的情況下，首次實現了對蛋白酶活力的快速靈敏檢測，可檢測到極微量(ng級)蛋白酶的活力[17]。此法及其衍生方法先后成功用于多種蛋白水解酶或其抑制劑的檢測、動力學分析及高通量篩選與分析研究[18-21]。

為了高效開發應用于食品加工、皮革制造、制藥、環保和發酵工業等領域的新型蛋白酶制劑，本文以氟硼熒熒光素標記大豆分離蛋白，以此為底物建立起蛋白水解酶活力的快速均相檢測方法，并就其方法學特征與可能的應用價值進行分析。所建立的新方法可以應用于現有工業蛋白酶制品的快速定量檢測，并有助于蛋白水解酶新酶的研究與開發。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶1∶250(>250 U/mg)，北京索萊寶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(≥100 000 U/g)、米曲霉酸性蛋白酶(≥100 000 U/g)、枯草桿菌中性蛋白水解酶(≥200 000 U/g)和地衣芽胞桿菌堿性蛋白水解酶(≥200 000 U/g)，江蘇銳陽生物科技有限公司；其他蛋白水解酶為本實驗室前期制備與保存。

BODIPY NHS Ester，西安瑞禧生物科技有限公司；PD-10脫鹽柱，上海根生生物科技有限公司；冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；Tecan infinite 200多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；L-酪氨酸和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；福林酚，索萊寶生物科技有限公司；所用的其他化學品均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 熒光素分子標記大豆分離蛋白

參考HAUGLAND[22]的方法以BODIPY NHS Ester標記大豆分離蛋白制備熒光底物。基本步驟為：適量熒光素溶液(5 mg BODIPY NHS Ester溶于0.5 mL DMSO)與10倍體積蛋白溶液(10 mg大豆分離蛋白溶于1 mL 0.1 mol/L NaHCO3緩沖液，pH 8.5)混合，置于200 r/min搖床，室溫下避光反應2 h；反應混合物通過PD-10脫鹽柱去除游離熒光素分子，收集蛋白組分，冷凍干燥，于-20 ℃避光保存備用。

1.2.2 均相法檢測蛋白水解酶活力

以緩沖液溶解熒光底物至10 μg/mL，與適度稀釋的酶液分別預熱至40 ℃，各取100 μL加入96孔板混勻，40 ℃下反應10 min，用酶標儀在激發波長500 nm、發射波長530 nm條件下檢測熒光。以底物和酶液作為對照。蛋白水解酶的活力用相對熒光強度(RFU)表示，按公式(1)計算：

RFU=FC-(FA+FB)

(1)

式中：FC為樣品熒光值；FA為底物熒光值；FB為酶液熒光值。

1.2.3 均相法的線性檢測范圍

以福林法[9]檢測胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、米曲霉酸性蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白水解酶和地衣芽胞桿菌堿性蛋白水解酶，5種工業蛋白酶活力。適度稀釋酶液，按1.2.2項方法于相應最適pH下反應并檢測熒光。以各蛋白酶福林法活力為橫坐標(X)，均相法相對熒光強度為縱坐標(Y)繪制標準曲線。

1.2.4 均相法的檢測限(DL)和定量限(QL)

按照1.2.3項建立的回歸直線方程確定DL和QL[23]，由方程(2)和(3)計算所得：

DL=3×Sb1/b

(2)

QL=10×Sb1/b

(3)

式中：Sb1為10個空白溶液的標準偏差；b為回歸方程的斜率。

1.2.5 均相法的檢測穩定性

配制一定濃度的胰蛋白酶溶液，按1.2.2項方法于pH 7.0(0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液)下反應并檢測熒光，每個濃度檢測6個平行樣品，計算6次檢測結果的相對標準偏差(RSD)。

1.2.6 均相法篩選新型蛋白水解酶

以本實驗室制備的8種內肽酶SubA、MepB、NadA、Sed2、PepX、HypB、DppD和ProtB為檢測對象，用福林法檢測酶活，適度稀釋后用均相法檢測酶活。

2 結果與分析

2.1 均相法的線性范圍

福林法標定的5種蛋白酶分別稀釋后用均相法進行酶活測定，結果匯總于圖1。

圖1 均相法相對熒光值和福林法酶活力之間的線性關系Fig.1 Linearity between relative fluorescence value of homogeneous method and enzyme activity determined by Folin method

胰蛋白酶檢測線性范圍為0.025～0.4 U/mL，擬合回歸方程為：y= 461 988x-744.45(R2=0.999 6)；米曲霉酸性蛋白酶檢測線性范圍為0.02～0.5 U/mL，擬合回歸方程為：y=473 787x+4 831.6(R2=0.999)；枯草桿菌中性蛋白酶檢測線性范圍為0.02～0.4 U/mL，擬合回歸方程為：y=470 829x-786.29(R2=0.993 5)；地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶檢測線性范圍為0.025～0.4 U/mL，擬合回歸方程為：y=572 251x+6 592.9(R2=0.996 8)；木瓜蛋白酶檢測線性范圍為0.02～0.5 U/mL，擬合回歸方程為：y=494 355x+319.87(R2=0.999 6)。在特定酶活范圍內，所測相對熒光強度與相應蛋白酶活力均呈現良好的線性關系，但各回歸方程斜率及線性范圍有所不同，這是基于2種檢測方法的原理不同。均相法檢測中，高濃度熒光分子以酰胺鍵結合在底物蛋白分子的N-末端氨基或側鏈(賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺)氨基，各熒光分子在空間距離上足夠接近而處于FRET狀態，只顯示極低熒光值，底物水解后肽鍵斷裂，底物蛋白構象發生改變，各熒光分子空間距離隨之變化，打破原來的FRET狀態，在激發光照射時顯示較高的熒光強度[24]。均相法檢測中熒光強度變化可以真實反映蛋白底物的肽鍵水解情況。福林法[12]檢測中，部分水解產物被三氯乙酸沉淀，而可溶部分又僅以酪氨酸和色氨酸進行顯色，不能全面反映蛋白底物的肽鍵水解情況。蛋白酶具有水解肽鍵的偏好性，作用于同一底物，不同蛋白酶對應產物的大小及氨基酸組成均有不同[1]。因此，對于5種所測試的工業蛋白酶，相同的福林法酶活力對應的均相法相對熒光強度有所不同，表現為回歸方程斜率和線性范圍差異。

2.2 均相法的檢測限(DL)和定量限(QL)

檢測10個空白溶液平行樣本并計算標準偏差，根據5種工業蛋白酶均相法檢測的回歸方程，確定相應檢測限和定量限，結果匯總于表1。

表1 均相法的檢測限和定量限Table 1 Detection limit and quantitative limit of homogeneous method

均相法檢測5種工業蛋白酶的檢測限和定量限結果接近但存在一定差異。如前所述，此差異仍由均相法和福林法檢測原理不同所致。均相法檢測5種工業蛋白酶的檢測限范圍為1.1×10-4～1.4×10-4U/mL，定量限范圍為3.7×10-4～4.5×10-4U/mL，相比國標福林法推薦的檢測范圍10～15 U/mL，均相法檢測靈敏度提高20 000倍以上。

2.3 均相法的穩定性

選擇胰蛋白酶考察均相法的穩定性，在線性范圍最低濃度(0.025 U/mL)、中間濃度(0.25 U/mL)及最高濃度(0.4 U/mL)做平行檢測，結果匯總于表2。各檢測點6次平行檢測確定的相對標準偏差都小于3%，表明均相法穩定性較好。

表2 均相法的穩定性分析結果Table 2 Stability analysis of homogeneous method

2.4 均相法用于蛋白水解酶的篩選

用均相法和福林法同時檢測8種內肽酶的酶活，結果匯總于表3。8種內肽酶的酶活用均相法全部檢出，而福林法僅檢測出其中3種內肽酶(SubA、MepB和PepX)的酶活。在均相法檢測結果中，NadA和Sed2酶活均高于PepX，后者以福林法可檢測出酶活，前2者卻未能檢出。根據檢測原理可知，NadA和Sed2對底物的水解作用強于PepX，但酶解產物中酪氨酸、色氨酸或相關寡肽的濃度卻低于PepX。HypB、DppD和ProtB以均相法檢測顯示出活力，說明其對底物有水解作用，但因酶解產物中酪氨酸、色氨酸或相關寡肽的濃度過低而不能由福林法檢測出酶活。

表3 均相法和福林法檢測多種內肽酶酶活比較Table 3 Detection of endopeptidases by homogeneous method and Folin method

注：括號內數值為酶活檢測pH值。

3 討論

本文以BODIPY NHS Ester熒光素分子標記大豆分離蛋白作為熒光底物，成功建立起工業蛋白酶活力的快速微量檢測方法。其線性檢測范圍、檢測限、定量限和穩定性等，可以滿足對常見工業蛋白酶活力的定量分析，與福林法所獲得的活力檢測結果也具有良好的對應關系。

福林法、茚三酮法、OPA法等傳統的蛋白水解酶活力測定方法，都需要對產物和底物進行分離后檢測，并需要顯色過程，操作步驟多，檢測耗時長[12,14,16]。本文建立的均相檢測法無需分離產物和底物，酶和底物反應完成后可以立刻讀取熒光值計算酶活，顯著提高了檢測效率，且靈敏度遠高于福林法。

均相法檢測是依據底物(蛋白質)在蛋白水解酶作用后，其空間結構被破壞，FRET狀態解除，經直接讀取反應體系的熒光強度變化，進行酶活檢測與定量[24]。據此原理，除以小分子量寡肽為底物的蛋白水解酶外，其他蛋白水解酶都可用均相法進行活力檢測與定量分析。運用所建立的方法，對采用福林法檢測活力比較困難的內肽酶，實現了活力測定，印證了均相法的檢測范圍更廣、靈敏度更高，結果顯示本法在研究新型蛋白水解酶時具有重要價值。

綜上所述，本文建立了一種高效快速、可以替代福林法進行工業蛋白水解酶活力檢測的方法。該方法的最大價值體現在對新型蛋白水解酶的檢測中，可以拓展新酶的發現。