阿托伐他汀通過內質網應激調節乙醇作用下AC16心肌細胞超微結構及脂質合成代謝

李寧，張航，于波

（ 中國醫科大學附屬第一醫院心內科，沈陽 110001）

酒精性心肌病是長期大量飲酒導致的非缺血性擴張型心肌病，臨床表現為心臟擴大、心功能不全和心律失常等［1］。研究［2-3］發現，酒精性心肌病的發病機制涉及多層次、多水平的機制，如乙醇代謝途徑的酶代謝及營養失衡、氧化應激、細胞壞死與凋亡以及鈣穩態失衡等。近年來，內質網應激 （endoplasmic reticulum stress，ERS） 在酒精性心肌病發病過程中的作用受到越來越多的重視。國內外學者針對ERS的研究目前多集中在肝臟、腎臟、神經系統、胰腺及部分腫瘤疾病［4-5］，較少針對心肌細胞，對酒精性心肌病細胞模型的相關研究更是少之又少。本研究在既往理論研究及實驗研究的基礎上，探討阿托伐他汀通過ERS對乙醇作用下心肌細胞超微結構及脂質合成代謝的影響機制，為將來的臨床研究提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 AC16心肌細胞的復蘇、培養與分組

取出液氮保存的AC16細胞 （購自南京科佰生物科技有限公司），立即37 ℃水浴快速解凍，中間過程輕搖冷凍管混勻，加速融化，完全融化后立刻離心。1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液。加入1 mL高糖DMEM完全培養基 （含10%胎牛血清，1%雙抗，購自美國Thermo Fisher Scientific公司） 重懸細胞沉淀，輕柔吹打均勻 （單細胞懸液） 后將細胞轉移到10 cm培養皿中，并調整細胞密度約為20%～25%，該密度范圍讓復蘇細胞有足夠的培養時間以調整到最佳狀態。CO2培養箱中培養 （37 ℃，5% CO2），間隔12 h后換液，棄去原有培養基，PBS漂洗2次，加入10 mL新鮮的高糖DMEM完全培養基，在倒置顯微鏡下觀察生長情況。之后2 d換液1次，每次吸棄原有培養基，更換10 mL新鮮的高糖DMEM完全培養基。待復蘇細胞生長至80%～90%密度，0.25%胰酶消化，至細胞變圓后吸棄胰酶，加入2～3 mL完全培養基脫離細胞并吹打至單細胞，按照1∶3比例傳代。傳代細胞貼壁12 h后換液，之后2 d 換液1次，2～3 d傳代1次。按照實驗條件添加不同濃度乙醇及阿托伐他汀至培養基中，培養48 h后收集細胞用于后續實驗。

實驗分組：正常組，未做任何處理，正常培養細胞；乙醇組，200 mmol/L乙醇處理AC16心肌細胞48 h；1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組，細胞處理基于乙醇組，分別使用1、10、100 μmol/L阿托伐他汀處理AC16心肌細胞48 h。

1.2 Western blotting

提取各組細胞總蛋白，BCA法 （試劑盒購自碧云天生物技術公司） 測蛋白濃度。根據蛋白分子量選擇所需要的SDS-PAGE凝膠濃度，SDS-PAGE電泳。轉膜后，加入用封閉液稀釋的葡萄糖調節蛋白78 （glucose-regulated protein 78，GRP78） 、固醇調節原件結合蛋白-1c （sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c） 和β-actin一抗，室溫搖床孵育2 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min。再加入用封閉液稀釋的相應二抗室溫搖床孵育1 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min。ECL顯色檢測。蛋白的相對表達量用待測蛋白與β-actin的灰度值比值計算。

1.3 電鏡觀察心肌細胞超微結構

收集細胞后，倒入2.5%戊二醛固定液，反應4 h。0.1 mol/L PBS清洗3次，30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脫水各1次，每次20 min。100%乙醇脫水2次，每次20 min，乙酸異戊酯置換2次，每次20 min。將細胞均勻涂布蓋玻片上，-70 ℃冷凍12 h，冷凍干燥48 h，將蓋玻片樣品噴金粉后上樣，觀察。

1.4 甘油三酯 （triglyceride，TG） 含量測定

收集細胞后，采用TG檢測試劑盒 （GPO-PAP單試劑微板法，購自北京欣華綠源科技有限公司） 檢測細胞內TG含量。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 乙醇作用下心肌細胞ERS模型的建立

乙醇 （200 mmol/L） 處理AC16心肌細胞0、12、24、48 h后，Western blotting檢測不同時間點GRP78蛋白表達。結果表明，實驗組內質網特異性分子伴侶GRP78蛋白相對表達量均顯著升高 （圖1）。針對Western blotting條帶進行灰度值定量分析，GRP78在0 h相對表達值為0.19±0.02，在12、24、48 h相對表達值分別為0.27±0.03、0.39±0.01、0.64±0.02。結果顯示，處理12、24、48 h后與0 h比較，GRP78蛋白表達的差異均有統計學意義 （均P ＜ 0.05）。表明乙醇作用下AC16心肌細胞ERS模型建立成功，且ERS效應具有時間依賴性。選取乙醇 （200 mmol/L） 處理AC16心肌細胞48 h，用于后續實驗。

2.2 不同濃度阿托伐他汀干預對乙醇作用下心肌細胞ERS狀態的影響

圖1 Western blotting檢測200 mmol/L乙醇處理AC16心肌細胞0、12、24、48 h后GRP78蛋白的表達Fig.1 Expression of GRP78 protein in myocardial AC16 cells treated with 200 mmol/L ethanol for 0，12，24，and 48 hours visualized using Western blotting

Western blotting檢測正常組、乙醇組以及1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組的GRP78蛋白的相對表達量，來衡量ERS狀態。結果顯示，與乙醇組比較，1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組GRP78蛋白的表達均顯著降低，差異均有統計學意義 （均P ＜ 0.05），見圖2、表1。表明阿托伐他汀可以有效緩解乙醇作用下心肌細胞ERS反應。

圖2 不同濃度阿托伐他汀干預下心肌細胞GRP78蛋白的相對表達量Fig.2 Relative expression of GRP78 protein in myocardial cells treated with different concentrations of atorvastatin

2.3 不同濃度阿托伐他汀干預對乙醇作用下心肌細胞超微結構的影響

電鏡觀察結果顯示，乙醇組AC16細胞形態異常，細胞內線粒體數量明顯減少、線粒體增大、線粒體嵴結構紊亂，時有線粒體嵴結構消失呈空泡樣改變。隨著阿托伐他汀干預濃度增加，AC16細胞形態及線粒體結構逐漸趨于正常，其中100 μmol/L阿托伐他汀組可見大量線粒體，呈橢圓形，線粒體嵴結構整齊，同正常組 （圖3）。表明阿托伐他汀干預可以緩解乙醇作用下心肌細胞超微結構的異常改變。

2.4 不同濃度阿托伐他汀干預對乙醇作用下心肌細胞脂質合成代謝的影響

檢測各組脂質合成代謝關鍵蛋白SREBP-1c及TG含量，結果顯示，與乙醇組相比，1、10、100 μmol/L阿托伐他汀組SREBP-1c和TG含量均顯著降低，差異均有統計學意義 （均P ＜ 0.05），見圖4、表1。

3 討論

內質網不只是真核細胞蛋白質合成和折疊、脂質合成以及細胞內儲存的亞細胞器，還是調節細胞應激與調亡的亞細胞器，因而對維持心肌細胞功能、蛋白質穩態具有重要作用。ERS是指多種因素導致的使細胞內質網生理功能發生紊亂的一種亞細胞器病理狀態。目前國內外研究者一致以內質網特異性分子伴侶GRP78蛋白作為ERS反應激活的標志［6］。早期文獻［7-8］報道ERS參與如糖尿病心肌病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血再灌注損傷等多種心血管疾病的發生發展，是心血管疾病的重要發病機制。近年來，不斷有研究［9］證明ERS在長期乙醇攝入所致的心肌損傷中也發揮著重要作用。

表1 各組中GRP78蛋白、SREBP-1c和TG相對含量Tab.1 Relative levels of GRP78 protein，SREBP-1c，and triglycerides in different groups

圖3 不同濃度阿托伐他汀干預對乙醇作用下心肌細胞超微結構的影響 ×500Fig.3 Effects of different concentrations of atorvastatin on ultrastructure of myocardial cells administered with alcohol ×500

圖4 不同濃度阿托伐他汀干預后心肌細胞SREBP-1c蛋白的相對 表達量Fig.4 Relative expression of SREBP-1c protein in myocardial cells upon treatment with different concentrations of atorvastatin

他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，具有競爭性抑制細胞內膽固醇的合成早期限速酶的活性，繼而上調細胞表面低密度脂蛋白受體，加速血漿低密度脂蛋白分解代謝的作用。近20年來，臨床研究［10-11］顯示他汀類藥物是當前防治高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化性疾病的重要的藥物。自從20世紀80年代以來，許多具有里程碑意義的研究證明了他汀類藥物在降低血脂方面的積極作用，表明其在心血管方面的許多作用獨立于其降低低密度脂蛋白的作用。各類文獻頻繁以“多效性”來概括其作用，其“多效性”作用包括抗炎、抗血小板聚集、抗氧化、穩定斑塊、改善內皮功能、調節免疫、動員內皮祖細胞、抗心律失常及預防碎死等作用。最新文獻［12］報道，他汀類藥物在ERS過程中具有確切的負性調節作用，可能是其發揮保護作用的多種機制之一，但具體機制尚不清楚。

基于以上研究進展及前期研究結果，為了進一步研究阿托伐他汀通過ERS對酒精性心肌病的影響，本研究首先構建了AC16心肌細胞ERS模型，在用200 mmol/L乙醇處理AC16心肌細胞后檢測GRP78蛋白表達，處理心肌細胞12、24、48 h后GRP78含量均較0 h顯著增加，表明AC16心肌細胞ERS模型建立成功。并且隨著處理時間的增加，GRP78表達量也隨之升高，推測在一定作用周期范圍內，ERS效應具有時間依賴性。隨后，本研究采用不同劑量 （1、10、100 μmol/L） 阿托伐他汀處理乙醇作用下心肌細胞48 h后，發現隨著阿托伐他汀劑量的增加，可以不同程度的降低GRP78蛋白表達水平，100 μmol/L時降低的最多，表明阿托伐他汀可以有效緩解乙醇作用下心肌細胞ERS反應。有關阿托伐他汀與ERS反應的研究，過去大多集中在缺血再灌注發生機制上，如XIA等［13］證實了阿托伐他汀處理具有改善心肌缺血再灌注損傷的保護作用，其機制可能與通過抑制ERS相關細胞凋亡有關；劉忠仁［14］通過觀察阿托伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注損傷后GRP78和GADD153蛋白表達的影響，證實ERS途徑可能是阿托伐他汀對心肌再灌注后損傷發揮保護作用的機制之一。這些結論與上述結果一致，也為探究酒精性心肌病中阿托伐他汀與ERS的關系提供了借鑒。

大量研究表明線粒體功能障礙是多種疾病的病理基礎，心肌作為高能量代謝組織，對線粒體功能改變更為敏感。MARN-GARCA等［15］證實心血管疾病、缺血性心肌病等均存在線粒體功能障礙，TERAGAKI等［16］在酒精性心肌病患者及動物模型中也發現心肌細胞線粒體結構及功能異常。本研究對不同處理組AC16細胞進行電鏡觀察，結果顯示乙醇組AC16細胞形態異常，細胞內線粒體數量明顯減少、線粒體增大、線粒體嵴結構紊亂，時有線粒體嵴結構消失呈空泡樣改變。隨著阿托伐他汀干預濃度增加，AC16細胞形態及線粒體結構逐漸趨于正常，其中100 μmol/L阿托伐他汀組可見大量線粒體，呈橢圓形，線粒體嵴結構整齊，同正常組，表明阿托伐他汀干預可以緩解乙醇作用下心肌細胞超微結構的異常改變，推測乙醇對酒精性心肌病發病的影響可能與其對線粒體生成的影響相關。

SREBP-1c是屬于“堿性螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈”鋅指結構域家族的轉錄因子，主要調控TG代謝，其他的亞型分子包括SREBP-1a和SREBP-2，主要調節膽固醇代謝。FANG等［17］研究表明，內質網穩態失衡不只影響蛋白質的合成，還引起脂肪酸和膽固醇的代謝紊亂，在這個過程中SREBP-1c是重要調節機制之一。通過檢測脂質合成代謝關鍵蛋白SREBP-1c和TG含量，檢測細胞內脂滴，從而探究阿托伐他汀對心肌細胞脂質合成代謝的影響。本研究檢測了SREBP-1c及TG含量，結果表明乙醇引發的ERS會顯著提高SREBP-1c及TG含量，而阿托伐他汀干預則可以緩解其異常表達。但是有關阿托伐他汀如何通過激活SREBP-1c促進脂質合成代謝，其機制仍不明確。

綜上所述，本研究進一步證實了ERS與脂質沉積的直接關系，并且證明阿托伐他汀可抑制乙醇作用下ERS相關因子GRP78表達，改善酒精性心肌病細胞模型細胞體態、線粒體超微結構及脂代謝情況。本研究在既往理論研究及實驗研究的基礎上，進一步說明阿托伐他汀通過ERS對乙醇作用下心肌細胞影響的變化規律，為將來的臨床研究提供可靠的依據。