煙草糖酯的分析與合成研究進展

陳 歡，羅昭標

（1.南昌工學院，江西 南昌 330108；2.江西省煙草公司撫州市公司，江西 撫州 344000）

糖酯是主要的煙葉表面化合物，廣泛存在于許多茄科植物的腺茸毛分泌物中，它們或以蔗糖酯（Sucrose Esters，SE）、葡萄糖酯（Glucose Esters，GE）或其混合物的形式出現。不同類型煙葉中糖酯的含量有所差異，在香料煙中的含量最高，在烤煙中含量居中，而在馬里蘭煙和白肋煙中的含量最低。糖酯類物質是煙用香精香料的重要組成成分之一，而且是許多揮發性香氣成分的前體物。糖酯也是一種表面活性劑，其在煙葉表面容易形成一層油水相隔的保護膜，具有保香、保濕和保潤功效。糖酯還可用作生物殺蟲劑，對人和恒溫動物無毒，同時具有抗微生物和調節植物生長作用[1]。

近年來，糖酯的功能與應用日益受到關注，綜述了煙草中糖酯的分類結構、提取分離、檢測分析和合成方法等方面的研究進展，并提出糖酯在這些方面的研究重點方向，旨在為糖酯研究提供參考。

1 煙草糖酯的分類

葡萄糖酯中，根據乙酰基的個數及取代位置不同，Shinozaki Y等人[2]把煙草中的葡萄糖酯分為3類。

葡萄糖酯的分類見圖1。

圖1 葡萄糖酯的分類

第1種類型的葡萄糖酯，有2個羥基被乙酰化，分別在C1和C6位，C2，C3，C4位上的羥基被短鏈脂肪酸酯化。第2種類型的葡萄糖酯只有C6位上羥基被乙酰化，C1位置上羥基處于游離狀態，C2，C3，C4位上羥基被短鏈脂肪酸酯化。第3種類型的葡萄糖酯中沒有乙酰基，C1和C6位上羥基都處于游離狀態，C2，C3，C4位上羥基被短鏈脂肪酸酯化。

蔗糖酯中，根據乙酰基是取代果糖環上的羥基還是葡萄糖環上的羥基，Severson R F等人[3]將煙草中的蔗糖酯分為了3類。

蔗糖酯的結構I-III見圖2。

圖2 蔗糖酯的結構I-III

普通煙草中的糖酯都屬于第1種類型，葡萄糖環上C6上羥基被乙酰化，C2，C3，C4的羥基被短鏈脂肪酸酯化，果糖環上的羥基全部處于游離狀態。Severson R F等人[4]從香料煙表面蠟質層分離出一系列這種類型糖酯，并用氣相色譜與質譜聯用技術將其分為6組，它們有著共同的結構特點：都是蔗糖四酯，葡萄糖環上C6被乙酰化，果糖環上羥基全部游離，C2，C3，C4的羥基被短鏈脂肪酸酰化，短鏈脂肪酸的碳鏈長度均為2-8。第2種類型和第3種類型的糖酯均存在于黏毛煙草中。

2 煙草糖酯的分析

2.1 煙草糖酯的提取方法

從新鮮煙葉提取糖酯，主要采用浸提法[5]，要求浸提時間盡量短，以防煙葉內部化學成分被浸出，通常每片葉片浸提3次，每次2～3 s。從調制后的葉片中提取糖酯，常用超聲波輔助萃取技術[6]，蔡莉莉等人[7]比較了超聲振蕩法和機械振蕩法對煙草中蔗糖酯提取效率的影響，結果表明，超聲振蕩法更適合用于煙草中蔗糖酯的提取。超聲波輔助萃取技術具有高效、節時、溶劑用量少、萃取完全、工藝簡單等優點，已廣泛用于煙草中各種有效成分的提取中。

提取溶劑的選擇是保證提取效率的關鍵。根據“相似相溶”原則選擇，主要為二氯甲烷[7]、三氯甲烷、乙腈[8]等。由于煙葉內部物質復雜，每類溶劑都存在一定的局限性。二氯甲烷會同時提取出煙葉表面的碳烴化合物，此類物質會對蔗糖酯的分離產生干擾，選用乙腈為提取溶劑，可避免上述問題[9]。三氯甲烷作提取溶劑，需加入乙醇作保護劑，而乙醇會分解衍生化試劑且很難被除去[10]。正己烷等烴類溶劑對極性的蔗糖酯類物質的溶解性比較差，甲醇和丙酮等能與水互溶的揮發性溶劑會使煙葉脫水，且非極性的糖酯類物質在其中的溶解性不好[11]。

2.2 煙草糖酯的純化方法

糖酯的純化方法主要有硅膠柱色譜法和液相色譜法2種。

2.2.1 硅膠柱色譜法

糖酯中含有羥基，有一定極性，硅膠中也有羥基，它們之間有著氫鍵作用。糖酯和洗脫劑與硅膠之間靠吸附-解析-吸附達到分離，影響分離的主要因素為糖酯與硅膠間的氫鍵作用力和樣品與洗脫劑間的作用力。因此，選擇合適的洗脫溶劑是有效分離的關鍵。一種單一溶劑往往難以達到好的分離效果，常選用混合溶劑以達到合適的溶劑強度。

硅膠柱層析是運用最多的方法，適用于中等分子量的化合物的分離，尤其是脂溶性的成分，層析效果由被分離化合物的性質、吸附劑和洗脫劑這3個因素決定。Severson R F等人[4]將液-液分離后的提取物Sephadex LH-20型凝膠層析柱，用氯仿淋洗，最后分離得到6種蔗糖酯，它們的主要不同是葡萄糖環上所連的脂肪酸不同。Shinozaki Y等人[2]將煙葉的三氯甲烷萃取物用硅膠柱最后得到4種蔗糖酯。Danehower D[11]用硅膠固相萃取柱分離煙葉的CH2CL2萃取物，氣相（GC）結果表明煙葉表面總物質的50%可以用這種方法洗掉，而99%的蔗糖酯保留在SPE柱上。Kandra O L等人[9]用乙腈作為提取溶劑從煙葉表面提取蔗糖酯類物質，用HPLC法氰基柱進行分離，共得到4種組分，最后一部分是蔗糖酯。

2.2.2 液相色譜法

液相色譜法就是用液體作為流動相，基于混合物中各組分對兩相親和力的差別進行分離的色譜法，根據吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。

Kandra O L等人[9]將萃取液用氮氣吹干，殘余物用10 mL水溶解和20 mL氯仿，分層后棄去水相，氯仿相用無水Na2SO4干燥和氮氣吹干后，再次溶解在10 mL氯仿中，用高效液相色譜法分離，得到4種餾分，最后一種餾分是蔗糖酯。Toshiake M等人[12]利用高效液相色譜法從不同品種煙葉表面提取物中分離得到了不同類型的蔗糖酯。Severson R F等人[13]用反相C18高效液相色譜柱，以乙腈∶水（V∶V）=1∶1為流動相，示差折光檢測器檢測，得到了糖酯類組分。

2.3 煙草糖酯的檢測分析

目前，糖酯結構的鑒定主要采用核磁共振（NMR）、紅外（IR）及質譜（MS）等方法，定性和定量則采用薄層色譜（TLC）法、液相色譜（HPLC）法或液相色譜與質譜聯用（HPLC/MS）、氣相色譜（GC）或氣相色譜與質譜連用（GC/MS）法。

2.3.1 TLC法

TLC法是從柱色譜發展而來的，其固定相采用的吸附劑比傳統柱色譜更細更均勻，具有較高的靈敏度。陽會兵等人[14]選取7個烤煙品種作為試驗對象，硅膠板作固定相，選用合適的展開劑和顯色劑，分離和分析了煙葉中的蔗糖酯含量。

2.3.2 GC或GC/MS法

糖酯的分子量較大且揮發性差，所以無法直接進行GC/MS分析，通常需要進行衍生化。衍生試劑一般選用N,O-雙-（三甲基硅烷基）-三氟乙酰胺，衍生時，需二甲基甲酰胺（DMF）作催化劑，水浴加熱，弱極性色譜柱。但是DMF具有較大的極性，會引起較嚴重的柱流失。且氣相色譜的檢測器為EI質譜時，硅烷化糖酯的分子離子峰不會出現。Einolf等人[15]采用直接化學離子化質譜（DCI/MS）法測定了煙草中蔗糖酯的含量。該方法中未對蔗糖酯進行衍生，而是使氨氣與蔗糖酯反應，這是因為反應產物的靈敏度和選擇性較高。

2.3.3 LC或LC/MS法

隨著LC/MS越來越多地被運用，越來越多的煙草化學研究者也開始探索該技術用于煙草中蔗糖酯的研究[16]，尤其是蔗糖酯葡萄糖環和果糖環上酰基取代類型的研究。Khorassani M A等人[17]用LC-MS法定性分析蔗糖酯時發現，蔗糖酯的酰基取代基的碳骨架中存在著不飽和鍵。

LC法可以直接對樣品進行分析，不需對樣品進行衍生化，但是由于糖酯類的紫外吸收很弱，液相色譜法中常規檢測器紫外檢測器無法滿足分析的要求，示差折光檢測器雖然可以用于分析，但其靈敏度較低，且不能進行梯度洗脫，所以目前運用LC法對煙葉中糖酯尤其是葡萄糖酯的分析很少見。

3 煙草糖酯的合成

3.1 煙草體內生物合成

煙草中的葡萄糖酯和蔗糖酯是在煙草茸毛腺細胞中合成的，是腺細胞的分泌物，這種分泌物連同煙草表皮和亞表皮分泌物一起在煙草的表面積累[18]，煙草和其他植物腺細胞合成蔗糖酯的主要原料是支鏈氨基酸和蔗糖新陳代謝產生的活化酸[19-20]。腺毛細胞有可能是進行生物合成的唯一場所，同樣的長鏈腺毛類型可以產生主要的流出成分，研究發現分離的腺毛細胞可以在有燈光的情況下從CO2合成蔗糖酯，這表明腺毛細胞可以進行光合作用，蔗糖和葡萄糖還可以通過碳酸氫鹽合成蔗糖酯的蔗糖部分，因此，蔗糖酯的蔗糖或葡萄糖部分是由轉移到腺體中的多糖經過蔗糖酶轉化為蔗糖的[9]。蔗糖酯的酰基部分可能是直鏈的也可能是支鏈的（異構的或反異構的），它們可能是通過2種途徑合成的：①脂肪酸合成酶或加長酶代謝；②α-酮酸加長途徑（α-KAE）。Kandra A B和Netab B[21-22]等人發現，煙草中蔗糖酯的酰基部分是通過α-KAE即支鏈氨基酸代謝的一種改進形式衍生的，該途徑中酰基主要是由α-KAE衍生的2-甲基丁酰基輔酶A(CoA)經過2-甲基支鏈CoA脫氫酶的轉化生成。引起煙草蔗糖酯酰基鏈型差異（異構或反異構、支鏈和直鏈）的原因尚不明確，可能是α-KAE的一種關鍵酶的底物專一性造成的[23]，可能是因為α-KAE中某些鏈的終止機制可導致酰基鏈長的差異，但這種推測還沒有被證實。目前，蔗糖酯合成中的酶及其調控基因還未得到分離和鑒定出，也未了解某些蔗糖酯中的乙酰基在果糖環上（C2，C3）和酰基在葡萄糖環上（C2，C3，C4）取代專一性的原因。

Kandra O L等人[9]研究了煙草腺毛中糖酯的形成及代謝過程。研究過程中將煙草腺毛細胞與表皮和亞表皮細胞分離開，2種細胞一起分別用CO2加乙酸酯培養，對代謝產物進行測定，結果發現只有帶腺毛細胞的體系能產生蔗糖酯。Einolf W N等人[24]對不同類型的煙草生長過程中的蔗糖酯含量進行測定。結果顯示，香料煙生長過程中蔗糖酯的累積量最高，其次是白肋煙，烤煙的積累量最少；并且隨著煙草的生長，其含量呈現出先增高后降低然后再增高的趨勢，并且含量在完熟時達到最高。

3.2 煙草體外化學合成

煙草中糖酯的結構比較特殊，用化學法合成，難度較大，目前國內外有關糖酯的合成的報道較少。最早合成出的糖酯是一種葡萄糖酯，即6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-（3-甲基戊酰基）-β-D-吡喃葡萄糖，對這種物質的鑒定是采用與從煙草中分離純化出的這種糖酯的結構進行比對，從而確定其結構。葡萄糖四元酯的合成以6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-異丁酰基-β-D-吡喃葡萄糖酯為例，其合成方法為以β-D-甲基吡喃葡萄糖苷為起始原料通過羥基保護和去保護法選擇性地合成目標產物。

煙草中蔗糖四元酯的合成過程需要先合成得到中間體6-O-乙酰基-3-O-烯丙基-1',3',4',6'-四-O-芐基-2-O-(4-甲氧基芐基)蔗糖。該中間體中的1',3',4',6'的羥基都連有芐基，從而起到保護這些位置羥基的作用，2,4位羥基通過酯化作用變成酰基，3位的烯丙基可以通過異構化和水解作用使其變成酰基。通過這一中間體合成的糖酯結構與煙草中所含糖酯的結構相同。Garegg R J等人[25]以蔗糖為原料，成功合成出6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-3-甲基戊酰基]蔗糖。Oscarson S等人[26]研究得到6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-2-甲基丁酰基]蔗糖和6-O-乙酰基-2,3,4-三-O-[(S)-2-甲基丁酰基]-二-O-[(S)-3-甲基戊酰基]蔗糖的3種同分異構體的合成方法。

4 結語

由于對煙草中的糖酯進行準確的定量分析需要參考標樣，而糖酯類物質在煙草中的含量很低，尤其是葡萄糖酯，且異構體較多，所以通過從煙草提取物中分離得到糖酯的純品，難度較大，因此化學法合成糖酯的方法還有待繼續研究。

目前關于煙草糖酯的研究不少，但大多數研究仍在沒有標樣的情況下用GC/MS或LC/MS進行，且主要集中于蔗糖酯，研究內容主要為提取、分離純化、結構鑒定和定量分析，對于葡萄糖酯，相關的報道只是關于提取分離純化及結構鑒定，定量分析的很少，因此葡萄糖酯的定量分析也是研究的重點與熱點。