乳蛋白抗氧化肽的研究進展

彭 巧，馬洪鑫，程 浩，張福梅，王亞杰，高丹丹

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124；2.西北民族大學實驗教學部，甘肅蘭州 730030）

人體細胞利用氧氣產生能量，而自由基是新陳代謝的結果。人體有相對穩定的抗氧化防御體系，但隨著年齡的增長或機體處于不良的外界環境時，體內的自由基產生過多或清除過慢會造成細胞生物膜被破壞、肽鏈特殊基團或肽鍵產生干擾及脫氧核糖核酸分子結構改變，進而引起多不飽和脂肪酸氧化，導致慢性和退行性疾病[1]。此外，食品氧化會使食品腐敗變質，甚至會產生致突變的物質。抗氧化劑是一種能夠延緩或抑制食物或人體氧化過程，預防氧化應激相關疾病的物質，具有阻止自由基的形成或清除自由基、過氧化氫和其他過氧化物，從而發揮抗氧化作用[2]。目前常見的化學合成抗氧化劑主要是酚類化合物，如2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、叔丁基對羥基茴香醚（BHA）、叔丁基氫醌（TBHQ）、沒食子酸丙酯（PG）等。這些抗氧化劑能通過釋放氫離子形成自由基，終止自由基傳遞鏈反應，從而阻斷油脂自動氧化，應用于食品中可以防止植物油的氧化酸敗、延長油脂的貯藏期，應用于化妝品中，可抑制皮脂的產生，降低皮膚表面色素的沉著度，有延緩衰老、抗皺去紋的功效。但是，這些化學抗氧化劑存在一定的毒理作用，Goodman D L等人[3]發現BHT與BHA似乎能夠加重某些慢性蕁麻疹患者的癥狀。有研究表明，服用大劑量TBHQ可引起惡心、虛脫、耳鳴、嘔吐和急性腦綜合征；可使兒童患多動癥、哮喘及皮炎、鼻炎炎癥，還可影響女性雌激素水平。我國對這些抗氧化劑的使用范圍和劑量也做出了嚴格的規定。因此、安全性高、副作用小的天然抗氧化劑更加受到人們的青睞，如黃酮、單寧、維生素類、茶多酚等。

近年來，乳源蛋白抗氧化肽的研究備受國內外學者的關注，許多學者從各類乳蛋白中發現了具有抗氧化活性的肽段。1979年，Brantl V等人[4]首次從牛乳酪蛋白中發現了具有類嗎啡活性的肽類物質，乳源生物活性肽的研究迅速發展。乳蛋白經消化后可以產生具有抗氧化活性的物質，這些物質是由1～20個氨基酸以不同組成和排列形式構成的肽類物質，其分子質量通常在5 ku以下。乳蛋白抗氧化肽能通過多種途徑抑制脂質氧化，包括活性氧的失活、自由基的清除、螯合金屬離子、減少氫過氧化物和改變食品體系的物理性質等，調整及改善機體生理功能，從而促進人體健康。主要介紹乳蛋白的分類、制備和分離純化乳源抗氧化肽的方法，分析抗氧化肽的研究現狀，為今后乳蛋白抗氧化肽及其相關產品的進一步研究奠定基礎。

1 乳蛋白分類

乳蛋白營養價值高，包含人體所需全部氨基酸，結構比例合理，能促進人體的生長發育和各項生理代謝活動；其生物價達到85，易被人體吸收，是有益于人體健康的優質蛋白質。乳蛋白按照在乳中呈現狀態可分為乳清蛋白、酪蛋白、部分的乳脂肪球膜蛋白和其他蛋白。

1.1 酪蛋白

酪蛋白又稱乳酪、干酪素，是動物乳中特有的一種含磷鈣的結合蛋白質。在牛乳、人乳、驢乳和羊乳中，其含量分別為總蛋白質的80%，29%，35%，75%[5]。酪蛋白分為αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三大類，其分子量大都在20～25 ku。其中含量最多的是αs-酪蛋白，在脫脂牛乳中αs-酪蛋白占總酪蛋白含量的38%。在總αs-酪蛋白中，80%為αs1-酪蛋白，分子量為23.5 ku；20%為αs2-酪蛋白，分子量為25.2 ku。β-酪蛋白含量比αs-酪蛋白略低，在牛乳脫脂乳中總酪蛋白含量為35%，分子量為24 ku。κ-酪蛋白含量在脫脂牛乳酪蛋白中約為13%，分子質量為19 ku；κ-酪蛋白對鈣不敏感而對凝乳酶敏感，是乳中唯一含有糖成分的酪蛋白[6]。

1.2 乳清蛋白

乳清蛋白是脫脂乳去除酪蛋白沉淀之后上清液中多種蛋白質組分的統稱，在牛乳總蛋白質含量的20%，在人乳中約為總蛋白質的71%，在驢乳中約為總蛋白質的64%，在羊乳中為總蛋白質的23%～25%[12]。乳清蛋白可分為α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、生物活性因子等。含量最多的是β-乳球蛋白，分子量為17 ku，為乳清蛋白總量的50%～55%；其次是α-乳白蛋白，分子量為12 ku，其含量與乳清蛋白總量的20%～25%；免疫球蛋白分為重鏈蛋白與輕鏈蛋白，重鏈的含量為10%～15%，牛血清白蛋白分子量為67 ku，其含量為乳清蛋白總含量的5%～10%，其他種類蛋白如乳鐵蛋白等共占乳清蛋白總含量的11.5%～17.0%[7-8]。

1.3 乳脂肪球膜蛋白

乳脂肪球膜蛋白以一種微小的球狀物存在于乳中，球狀直徑為0.2～15.0μm，被一層乳脂肪球膜包裹著。乳脂肪膜球蛋白是一種膜結合蛋白，含有25%～60%的蛋白質，占乳中蛋白質的1%～2%[9]。

1.4 其他蛋白

除以上幾種特殊蛋白質外，乳蛋白還含少量的其他蛋白質和酶蛋白，如酒精可溶性蛋白及血纖蛋白相類似的蛋白。

2 乳源抗氧化肽的制備

乳蛋白抗氧化肽常用的制備方法有酶法與微生物發酵法2種。酶法制備中常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶和木瓜蛋白酶等，酶法反應條件溫和、無異味、安全、催化位置有方向性，但反應副產物多、產率低。微生物發酵法是利用瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌及鼠李糖乳桿菌GG株等微生物，在有氧或無氧條件下的生命活動來生產不同氨基酸序列和分子量的肽，這些肽類是微生物菌體本身，或者直接代謝產物或次級代謝產物，微生物種類多、繁殖快、培養簡單，利用其法制備成本低、產率高，但存在菌種不穩定、易產生變異、產物不穩定等缺點。近年來，國內外學者采用微生物法和酶法水解不同乳蛋白制備了大量乳源抗氧化肽，并對其序列進行分離純化。

乳源性抗氧化肽的制備方法及其序列見表1。

3 乳蛋白抗氧化肽的分離純化及鑒定

乳蛋白抗氧化肽的氨基酸序列，直接影響其抗氧化活性。對其進行分離純化和鑒定，對進一步研究其構效關系有很大的意義。目前常用的方法主要有超濾、離子交換、凝膠層析、親和層析、高效液相色譜（HPLC）、毛細管電泳和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）等。

3.1 超濾

超濾是一種依據膜截留分子量來分離物質的技術，即在一定壓力（一般為0.1～0.5 MPa）下，樣品被壓入系統，不同分子量的物質經過膜時，超過膜體積的大分子物質被膜體積截留并作為濃縮物再循環，溶劑和小分子物質將通過膜并作為滲透劑被收集，從而達到分離純化的目的。在分離純化乳蛋白抗氧化肽時，通常把超濾作為初步分離的手段。Chang O K等人[28]將牛酪蛋白水解產物超濾24 h，分離出＞10 ku，3～10 ku，＜3 ku 3個組分，發現＜3 ku組分顯示出最高的抗氧化活性。Puchalska P等人[33]采用3，5，10 ku的分子量截流過濾器對一定濃度的嬰兒配方奶粉進行超濾，得到分子量為5～10 ku，3～5 ku和小于3 ku的3個級分，然后進一步分離純化，鑒定出內源抗氧化肽和ACE抑制肽的序列結構。Kumar D等人[34]采用超濾技術對駱駝乳蛋白水解產物進行分餾，在組分F2（1～5 ku）和F3（5～10 ku）均表現出較高的抗氧化活性，表明駱駝乳蛋白是生產蛋白質水解物的有價值的來源。

表1 乳源性抗氧化肽的制備方法及其序列

3.2 凝膠層析

凝膠層析可用于分離不同大小的分子。凝膠過濾柱的柱材由交聯聚丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖等凝膠顆粒構成，目前常用的葡聚糖凝膠有Sephadex和Sephacryl兩大類。樣品進入凝膠過濾柱后，由于分子量大的物料直徑比凝膠顆粒孔徑大，在凝膠顆粒間的空隙流動速率快而最先被洗脫，反之，分子量小的物料由于直徑比凝膠顆粒孔徑小可自由進出凝膠顆粒，在層析過程中，由一個凝膠顆粒進入另一個凝膠顆粒，流動速率慢而最后被洗脫。目前，凝膠層析技術，并已成功地應用于凝膠層析技術，并已成功地應用于純化各種來源的蛋白質和多肽。郁曉盼[35]通過對比SephadexG-25和SephadexG-15凝膠層析處理超濾過的牛乳酪蛋白酶解液的存在的差異，發現2種處理液都有4個主要洗脫峰，同時SephadexG-15的分離度要高于SephadexG-25，這與2種凝膠的分離范圍有關。Peng X等人[36]應用SephadexG-10凝膠過濾層析處理堿性酶水解后的乳清蛋白得到4個組分：＞40 ku，2.8～40 ku，0.1～2.8 ku和＜0.1 ku肽段。Tugba Bayram等人[37]現采用SephadexG-200柱層析處理乳清液得到3個組分，然后再將含有對乳球蛋白和α-乳球蛋白的組分經SephadexG-200柱層析，得到3個組分：第1組為牛血清白蛋白，第2組為β-乳球蛋白，第3組為小肽。

3.3 高效液相色譜（HPLC）

高效液相色譜法是借助高壓將樣品注入系統，各成分發生分離后，然后進入檢測器檢測，從而實現對樣品的分離鑒定的分析方法。目前，應用于多肽分離純化的高效液相色譜法主要分為多維高效液相色譜、反相高效液相色譜法、離子交換色譜與質譜聯用法等。Tsopmo A等人[38]采用高效液相色譜法（HPLC）分離人乳水解物得到23個組分，其中色氨酸（Trp）、多肽HNPI和PLAPQA是主要成分。Hernandezledesma B等人[39]采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）對發酵乳大部分活性組分的多肽進行了串聯質譜測定，識別出了各種潛在的活性多肽。Jrad Z等人[40]在研究駱駝奶和駱駝初乳蛋白的生物活性片段中，采用反相高效液相色譜對蛋白質的水解物進行了表征，根據峰值發現大多數蛋白質被水解成小肽。

3.4 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDITOF-MS）

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜工作原理是樣品與小分子基質均勻混合，在離子源室內，基質與樣品之間發生電荷轉移，使樣品分子離子化；然后在電場作用下進入飛行時間質量分析器中加速，由到達檢測器的飛行時間算出其質荷比，對樣品進行定量定性分析[41]。其法操作簡單且快速、精確度高、檢測質量范圍廣，適合于各種多肽精確質量數測定。劉志東等人[12]采用MALDI-TOF-MS法鑒定出牛乳乳清蛋白中具有抗氧化活性的肽段序列為HIR。Homayounitabrizi M等人[19]利用MALDI-TOF-MS法測定出駱駝乳蛋白水解物中的3種多肽序列。Ibrahim H R等人[20]通過MALDI-TOF-MS法分析駱駝奶蛋白水解液中的活性肽，鑒定了多種質量范圍在913～2 951 Da的抗氧化肽。

4 結語

乳源抗氧化肽在促進人體健康和預防疾病方面有較高的生物價值，可作為抗氧化劑應用到功能性食品或保健品中，可有效預防人體各種慢性疾病，也可以緩解相關疾病的癥狀，如肥胖、腫瘤、血管硬化、心腦血管疾病、炎癥疾病等；此外，抗氧化肽還具有清除皮膚中的自由基，減少或預防皮膚老化的潛能。目前，許多研究者已經從乳源蛋白水解物中獲得了很多抗氧化肽，并鑒定出了其結構序列，但是應用于工業生產和臨床干預的抗氧化肽并不多。主要是與化學合成抗氧化劑相比，大多數乳源性抗氧化肽的活性和體內穩定性相對較低，其作用機制和構效關系的研究較少，目前已建立的構效關系模型缺乏代表性，無法解釋所有類型抗氧化肽的作用機制，限制其進一步開發利用。因此，乳源蛋白抗氧化肽的定向修飾技術進一步改進和構效關系的進一步深入研究，將打破這些瓶頸問題，為乳源蛋白抗氧化肽的開發利用奠定基礎。