季節與小生境對喀斯特灌叢土壤叢枝菌根真菌群落的影響

趙蕾，蓋爽爽，鄭生猛，胡亞軍，劉華英，何尋陽*

（1. 廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541000；2. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；3. 中國科學院環江喀斯特生態系統觀測研究站，廣西 環江 547100；4. 廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西 柳州 545000）

喀斯特是一種具有特殊物質、能量、結構和功能的生態系統，由具有溶蝕力的水對可溶性巖石進行溶蝕等作用而形成。喀斯特地區碳酸鹽巖充分發育，土壤呈中性至微堿性，土體不連續，土層淺薄[1]。生境泛指生物個體或群落所在的具體地段環境，小生境是在外部形態上可以明顯區分、在內涵上具有不同生態有效性的不同小單元[2]。小生境根據微地貌形態共劃分為6種類型：石面、土面、石溝、石縫、石坑、石洞[3]，喀斯特生境常以石面、土面、石溝、或幾種類型組合鑲嵌的形式存在。其中石土面及土面以30%巖石裸露率為區分。石土面巖石裸露率大于30%，是類似土面的小型臺地[4]；土面巖石裸露率低于30%，長寬面積相對較大且土層覆蓋均勻，較適宜植物生長，其上分布的植物種類和數量最多，是喀斯特區植被恢復和人工造林的主要利用類型[5]。多樣化的小生境也造成土壤養分水分及植物多樣化的時空分布格局[6]。西南喀斯特地區存在明顯旱雨季，夏季雨量充沛，溫度高，濕度大，是植物生長的旺盛季節，植物的生產力高。冬季存在季節性干旱，雨量稀少，溫度、濕度低，是大多植物的休眠季節。灌叢在喀斯特地區分布范圍廣泛，是喀斯特地區石漠化過程中重要的過渡類型，在整個植被演替變化中處于不穩定階段。生境良好且人為干擾較少的情況下，喀斯特灌叢可能正向演替為森林植被，反之加速巖石裸露的石漠化進程[7]。結合地下微生物調控喀斯特灌叢群落正向演替可能是改善喀斯特脆弱生境的有效途徑之一。

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是生態系統中重要的功能微生物，能與80%左右的陸地植物形成共生關系[8]，大量研究表明，接種AMF能提高宿主植物養分吸收，改善水分代謝[9]，近年來被開發為脆弱生態環境恢復的生物治理手段[10]。AMF多樣性與土壤、氣候、及地上植物等環境因子的關系近年來被研究者廣泛討論。Lugo和Cabello[11]研究了3種禾本科的C3代謝植物、2種禾本科及1種薔薇科的C4代謝植物的宿主物種及其代謝類型、季節變化和放牧對AMF多樣性的影響，結果表明AMF的Shannon多樣性、豐富度和均勻度沒有變化，但菌根真菌侵染密度受季節和宿主代謝途徑的強烈影響。Guadarrama等[12]對墨西哥季節性干旱森林干/濕兩季土壤AMF孢子進行分離和鑒定以研究AMF豐度、豐富度和多樣性的季節變化，結果表明AMF豐富度在干濕地塊和季節中存在顯著差異，季節變化對AMF多樣性有很大影響，但對AMF感染性沒有影響。這些相關研究表明季節是影響AMF群落變化的重要因素。但也有研究表明，不論是根際中還是土壤中所含的AMF群落，其組成結構等均不受季節變換的影響[13]。已有研究表明，植物與AMF共生模式在提高喀斯特生態系統穩定性和石漠化治理實踐中表現了潛在利用價值[14]，但仍缺乏針對喀斯特峰叢洼地灌叢生態系統、不同季節與不同小生境土壤AMF群落研究，而揭示作為喀斯特植被正向演替過渡階段——灌叢生態系統不同小生境下，土壤AMF的季節變化特征及其影響因子，是合理利用AMF促進喀斯特退化區生態恢復的前提。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與樣地遴選

研究區位于桂西北典型喀斯特峰叢洼地的廣西壯族自治區環江毛南族自治縣 (107°51′-108°43′E，24°44′-25°33′N)。屬南亞熱帶向中亞熱帶過渡的季風氣候區。其中南部邊緣地帶屬南亞熱帶季風氣候，中、南部及大、小環江河谷地帶屬中亞熱帶谷地氣候。全縣氣候溫和，雨水充沛、日照充足、冬暖夏涼、雨熱同季、無霜期長。年均氣溫南部丘陵一帶19.9 ℃，北部山區15.7 ℃。全縣一月平均氣溫10.1 ℃，七月平均氣溫28 ℃；歷年最低氣溫-5.2 ℃，無霜期290 d。全年可照時數4 422 h，全年太陽輻射量98.89 kJ/cm2。年平均降雨量1750 mm，降雨多集中于4至9月份，占全年降雨量的70%；歷年最小降雨量922.8 mm，蒸發量1 571.1 mm，空氣平均相對濕度79%。經充分勘探后選擇了中國科學院環江喀斯特生態系統觀測站一處受人為等因素干擾退化，經封育后自然恢復良好的典型喀斯特峰叢坡面灌叢群落，選取植被類型基本一致的1 hm2（100 m ×100 m）面積作為研究樣地。

1.2 植被調查與土壤樣品采集

在樣區內采用Topcon全站儀把樣地劃分為100個10 m × 10 m相鄰的網格樣方，經充分勘察后，該樣地主要以石土面、土面、石面小生境為主，按傳統劃分喀斯特異質性小生境的方法[15]，基于土被的分布和微地貌特征，劃分小生境樣區并測量其分布面積，分別于2014年7月（夏季）、2016年1月（冬季）開展土壤樣品采樣工作，每個樣區采用多點（10點）混合取樣法組成一個混合樣品，采集表層0-15 cm土壤樣品約500 g（若土層厚度不到15 cm，則采集至可達深度）；采用四分法取土約30 g作為分子試驗用樣，經液氮速凍后，放置于-80 ℃冰箱保存；植被調查于2014年7月至8月進行。其余土壤樣品經自然風干后，用于常規理化指標的測定。最終采集石土面、土面樣品數分別為19個和5個，參照5個土面樣方面積大小（25-250 m2）對應篩選面積接近的5個石土面樣品做后續分析。

1.3 土壤理化性質測定方法

采用pH計測定土壤pH值（水土比=2.5∶1）；重鉻酸鉀容量法-外加熱法測定土壤有機碳（SOC）；0.5 mol/L的Na2CO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤有效磷（AP）；中性醋酸銨浸提-火焰光度法測定有效鉀（AK）；堿解-擴散法測定堿解氮（AN），具體實驗操作參照鮑士旦《土壤農化分析》[16]。

1.4 DNA提取、擴增及高通量測序

采用土壤DNA提取試劑盒（Fast DNA?SPIN Kit for Soil，MP）提取微生物DNA。具體的操作步驟嚴格按照試劑盒說明書執行。提取完成后，分別采用濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳及核酸檢測儀觀測擴增樣品的片段長度及DNA濃度，并記錄每個樣品的OD260/280、OD260/230及其DNA濃度含量。確定樣品質量完全符合后續試驗條件的要求后分裝備用。

AMF的18s rRNA擴增采用巢式PCR技術，使用的第1對擴增引物為AML1（5'-ATCAACTTTCGAT GGTAGGATAGA-3'）/AML2（3'-GAACCCAAACAC TTTGGTTTCC-5'），目的片段長度在500 bp左右[17]；第2對擴增引物是AMV4.5NF（5'-AAGCTCGTAGT TGAATTTCG-3'）/AMDGR（3'-CCCAACTATCCCT ATTATCAT-5'）引物，目的基因片段長度約 250 bp[18]。以上引物均由上海英濰捷基貿易有限公司合成提供。第1步擴增體系20 μL，包括1 μL DNA模板，上游和下游引物各0.5 μL，2×PCR Ex Taq （TaKaRa, Japan）10 μL，ddH2O 補至 20 μL。程序設定 94 ℃ /5 min，94 ℃ /30 s、58 ℃ /45 s、72 ℃ /1 min， 35 個循環，最后72 ℃延伸10 min。將結束后的PCR產物稀釋50倍取1 μL作為第2步DNA模板，擴增體系同樣為20 μL，上下游引物各 0.5 μL，2×PCR Ex Taq（TaKaRa,Japan）10 μL，ddH2O 補 至 20 μL。 程 序 設 定 94℃ /3 min，94 ℃ /45 s、60 ℃ /45 s、72 ℃ /1 min，30個循環，最后72 ℃延伸10 min。

高通量測序采用Hiseq2500平臺完成，基于Illumina成熟的邊合成邊測序（SBS）原理進行[19]。HiSeq2500測序與其他高通量測序一樣都有其固定的測序引物，在上述第2步擴增體系中，上下游引物5'端添加7個堿基的特定Barcode序列，再對其進行PCR擴增，目的是識別同一批測序數據中不同的樣品數據，保證多個樣品能夠同時上機測序。在將得到的PCR產物按要求保存，送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行測序。

1.5 數據統計分析

Hiseq高通量數據采用QIIME 2.0和Mothur平臺分析。高通量數據質量控制標準：去除堿基質量值（Q值）低于30的序列；去除序列長度小于200 bp，大于250 bp的序列；去除嵌合體及非AMF序列。余下序列以97%相似度進行聚類，提取代表序列在NCBI數據庫和MAARJ AM數據庫進行物種比對。使用R（vegen包）計算AMF和植被群落多樣性指數及MRPP組間差異分析。使用PASW Statistics 18中重復測量方差分析（Within-subjects ANOVA）檢驗季節和生境對AMF群落豐富度的影響，采用獨立配對T檢驗及pearson相關性分析，分別進行分類間顯著差異性及相關性分析。使用Canoco 5.0對AMF群落進行非度量多維尺度分析（Non-metric Multidimensional scaling，NMDS）及其與環境因子的冗余分析（Redundancy ananlysis，RDA）。采用Origin 8.5軟件進行后續處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 小生境與季節對土壤理化性質的影響

土壤部分理化性質指標在季節與生境之間存在差異（表1）。冬季兩種小生境間AK（P=0.000）存在極顯著差異；夏季兩種小生境間pH（P=0.046）、SOC（P=0.024）存在顯著差異；石土面AK（P=0.009）在兩種季節間差異極顯著；土面AP（P=0.025）在兩種季節間差異顯著，AK（P=0.003）差異極顯著。

2.2 土壤AMF群落組成結構

喀斯特地區灌叢群落含有豐富的叢枝菌根真菌，所有土壤樣品測序共得到2 008 658條有效序列，序列平均長度217 bp。AMF序列數1 300 558條，各樣品菌根真菌序列數不等(20 315-34 083條)，平均約27 095條。篩選最終所得AMF序列總數975 120，分類為154個OTUs，每個樣品的OTU個數在93-121之間。數據庫中比對后所得AM真菌7科8屬，分別為球囊霉科球囊霉屬（GlomeraceaeGlomus）、近明球囊霉科近明球囊霉屬（ClaroideoglomeraceaeClaroideoglomus）、類球囊霉科類球囊霉屬（ParaglomeraceaeParaglomus）、多樣孢囊霉科多樣孢囊霉屬（DiversisporaceaeDiversispora）及雷德克囊霉屬（Redeckera）、無梗囊霉科無梗囊霉屬（AcaulosporaceaeAcaulospora）、巨孢囊霉科盾巨孢囊霉屬（GigasporaceaeScutellospora）、雙型囊霉科雙型囊霉屬（AmbisporaceaeAmbispora）。其中，球囊霉屬的相對豐度在兩種季節和生境間均居最高，其冬季相對豐度接近90%，夏季約占75%左右。與球囊霉屬的季節分布高低趨勢相反，相對豐度次之的近明球囊霉屬冬季占比低于夏季，類球囊霉屬、多樣孢囊霉屬、無梗囊霉屬也呈現同樣趨勢。雙型囊霉屬只存在于冬季石土面，其相對豐度僅0.03%。顯著差異性分析表明，球囊霉屬和多樣孢囊霉屬在季節間存在顯著差異，在生境間僅有盾巨孢囊霉屬存在顯著差異（圖1）。

表1 土壤理化性質Table 1 Physi-chemical properties of studied soils

圖1 土壤AMF群落屬分類水平下相對豐度比較Fig. 1 Comparisons on relative abundance of soil AMF genera between different treatments

圖2 土壤AMF群落種分類水平下相對豐度比較Fig. 2 Comparisons on relative abundance of soil AMF taxonomic species between different treatments

為在種的水平反映不同季節及小生境樣品間AMF群落物種結構的異同，挑選相對豐度大于1%的OTUs作進一步分析（圖2）。結果顯示，冬季石土面、土面，夏季石土面、土面各有25、20、23、27個優勢種，且優勢種相對豐度之和均超80%，其中，有7個優勢種相對豐度具有顯著的季節變化：OTU25（Glomus Kohout14 A-4；冬季17.77%、夏季9.40%）、OTU3（Glomus sp. VTX00393；冬季5.50%、夏季3.65%）、OTU250（Glomus sp. VTX00202；冬季 3.95%、夏季 2.14%）、OTU53（Glomus Chen14 DL-Glo12；冬 季 2.06%、 夏 季 1.23%）、OTU27（Glomus sp. VTX00120；冬季1.78%、夏季1.21%）、OTU82（Glomus sp. VTX00120；冬 季 1.51%、 夏季0.92%）和OTU32（Glomus sp. VTX00113；冬季1.20%、夏季0.39%）。生境間僅有OTU22（Glomus sp. VTX00064；石土面9.31%、土面3.94%）和OTU119（Glomus GlAd1.2 VTX00288；石土面0.46%、土面0.95%）的相對豐度具有顯著性差異。另外，冬季石土面和土面相對豐度最高的種同為OTU25，夏季石土面的則為OTU22，均屬于球囊霉屬，而夏季土面為OTU6（Paraglomus sp. VTX00001），為類球囊霉屬。

測序所得154條OTU中有117條為共有OTUs（圖3）。近明球囊霉屬OTU108（Claroideoglomus sp. VTX00276）與4種球囊霉屬OTU50（Glomus sp. VTX00077）、OTU201（Glomus sp. VTX00085）、OTU212（Glomus sp. VTX00121） 和 OTU343（Glomus Glo16 VTX00120）只存在于冬季；類球 囊 霉 屬 OTU4（Paraglomus Alguacil14b Para2 VTX00348）只存在于夏季。OTU213（Glomus sp.VTX00342）為石土面特有，類球囊霉屬OTU15（Paraglomus sp. VTX00375）、近明球囊霉屬OTU19（Claroideoglomus sp. VTX00193）為夏季石土面特有；雙型囊霉屬OTU12（Ambispora sp. VTX00283）、OTU73（Ambispora PF27 VTX00283）及多樣孢囊霉屬OTU99（Diversispora sp. VTX00356）為冬季石土面特有。

圖3 土壤AMF OTUs組成Venn圖Fig. 3 Venn diagram of AMF OTUs in different seasons and microhabitats

2.3 土壤AMF物種多樣性

冬季石土面、土面及夏季石土面、土面實測OTUs個數分別為147，142，139和131，雙因素重復測量方差分析結果表明，季節對土壤AMF群落豐富度影響極顯著（P=0.007），冬季AMF資源較夏季更豐富，但生境類型、季節與生境類型的交互作用對AMF群落Shannon多樣性與均勻度（E）的影響不顯著（圖4）。

圖4 土壤AMF群落多樣性Fig. 4 The AMF community diversities in different seasonsand microhabitats

圖5 AMF群落特征（A）及其影響因子（B）Fig. 5 The characteristics of AMF community (A) and its Influencing factors (B)

2.4 土壤AMF群落分布的影響因子

NMDS（圖5A）結果顯示，AMF群落分布存在明顯季節差異，冬季群落分布較夏季集中。MRPP分析結果也表明，石土面（P=0.038）、土面（P=0.044）均在季節間表現出顯著差異，而在同季節內的小生境間差異不顯著。表明季節顯著影響AMF群落分布。

以土壤理化指標與植物豐富度為環境因子的RDA（圖5B）分析結果顯示，第一軸和第二軸的解釋量分別為30.76%和15.59%，蒙特卡洛檢驗依據各指標的解釋貢獻率排序，表明AP（F=4.0，P=0.012）、AK（F=4.3，P=0.008）及植物豐富度（F=3.8，P=0.002）是影響叢枝菌根真菌群落分布的主要因子（P＜0.05），共解釋47.30%變異。

3 討論

3.1 土壤AMF群落對小生境與季節變化的響應

球囊霉屬是喀斯特地區叢枝菌根真菌絕對優勢種，這與球囊霉屬具有較強嚴峻環境的適應性一致。如內蒙古、寧夏、甘肅鹽堿地發現優勢種屬為球囊霉屬[20]，在長期受重金屬污染的土壤中也廣泛分布[21]。另外，球囊霉屬在整個研究區的相對豐度占比70%以上，此結果高于多數非喀斯特地區球囊霉屬所占比例[22]，可能的原因是AMF屬于好氣性真菌，喀斯特表層土壤有機質含量相對非喀斯特高，且土壤顆粒間隙較大[23]，良好的通透性能給AMF帶來更好的生存環境。兩種季節和小生境下的AMF的Shannon多樣性指數和物種豐富度的平均值分別為3.18和108，高于崢嶸等[24]在內蒙古大青山地區的結果，該地區為栗鈣土和灰褐土，這可能主要與喀斯特生態系統較強異質性和較高的植物多樣性有關。地貌多樣性是生物多樣性的基礎[25]，小生境異質性能改善地區生態服務功能，增加物種多樣性[26]。由于喀斯特地區地表破碎度高、小生境豐富多樣的特殊地質背景，在微地貌水平形成了光熱和水分差異的小氣候特征，導致土壤理化性質（表1）及植被種類的不同[27]。此外，夏季及冬季的石土面AMF豐富度均較土面的高，推測是因為石土面土層相對土面的薄，水分涵養能力相對較低，且異質性相對更強，從而造成了更多微生態位供土壤AMF共存。

以往研究表明，AMF侵染率、多樣性和群落組成均存在季節性變化規律[28-30]，也有結果認為AMF群落組成和多樣性無季節性差異[31]。本研究中，AMF群落分布呈現顯著的季節差異，冬季AMF的Shannon多樣性及豐富度（H=3.27, S=114.80）均分別高于夏季的（H=3.09, S=102.90）。AMF依賴宿主植物光合作用提供碳水化合物，不同季節的植物處于不同生長階段，自身對碳水化合物的需求存在差異，夏季植物為滿足地上部分快速生長需要，對碳水化合物和磷的需求增加[32-33]，間接影響AMF豐富度和多樣性；而冬季植物代謝大大降低，且較低的溫度降低植物從土壤中吸收養分的速率[34]，同時，喀斯特區冬季季節性的干旱也增加了植物對AMF共生以緩解水分脅迫的需求。

3.2 高異質性喀斯特土壤AMF群落的影響因子

在本研究的各速效養分中，速效磷與速效鉀對AMF群落影響極顯著。大量研究表明磷是影響AMF群落組成的關鍵因子[35-36]。魏源等[37]發現土壤磷對貴州茂蘭喀斯特森林土壤AMF的定殖和產孢都具有很大影響，不同小生境間這些生態因子，如磷和有機質的顯著差異，是導致小生境間AMF多樣性指數和物種豐富度差異顯著的主要原因。長期以來人們大多關注磷與AMF的密切關系，但近年來，我們的前期研究[38]和其他不少研究表明[39-40]，土壤鉀素營養對AMF群落及多樣性也存在顯著影響，因此，土壤鉀素營養對于土壤AMF群落組成結構與功能的影響需引起足夠的重視。

Martínez-García 等[41]認為，植物物種對 AMF群落組成結構的影響大于土壤養分。在本研究結果中，植物豐富度極顯著影響AMF群落結構組成，這與梁月明等[42]的結果一致。植物主要通過其根際分泌物影響根際微生物群落組成結構[43]，喀斯特高度空間異質性小生境孕育著不同物種組成的植物群落，而不同物種對土壤AMF具有一定的偏好性。

4 結論

1）球囊霉屬（種）是喀斯特灌叢土壤AMF群落優勢屬（種）。季節是影響喀斯特灌叢生態系統土壤AMF群落的重要環境因素：夏季與冬季土壤AMF群落組成結構差異顯著，且豐富度在冬季極顯著高于夏季；總體上，小生境類型對土壤AMF群落組成、多樣性及豐富度影響均不大，因此利用AMF促進喀斯特峰叢洼地植被恢復可以不考慮小生境的異質性分布。

2）植物豐富度、土壤速效磷和速效鉀顯著影響喀斯特土壤AMF群落，說明喀斯特土壤AMF存在明顯植物群落多樣性依賴，且受控土壤有效磷和速效鉀供給，因此，營造高植物物種多樣性和改善土壤磷鉀供給，有望加強AMF促進喀斯特退化植被恢復效應。