趕黃草揮發油GC-MS分析及保肝靶點篩選

楊 欣，李亞輝，劉 明，呂潤霖，錢海兵

貴州中醫藥大學基礎醫學院，貴陽 550025

中藥趕黃草最早載于《救荒本草》，為苗族民間治療肝病的常用藥，主要分布在四川、貴州、湖南等地，具有清熱解毒、退黃化濕，活血散瘀，利水消腫之功效，以全草入藥[1]。目前，已有多項研究表明，趕黃草的多種活性成分具有保肝作用，對肝臟功能有調節作用，特別是對酒精性脂肪肝、肝纖維化和肝硬化有顯著治療作用[2]。中藥材在保肝上凸顯重要優勢[3]，但是中藥材化學成分多，需要通過大量工作篩選保肝的活性成分及靶點。隨著科學技術的不斷發現，網絡藥理學和分子對接技術的出現，多學科的相互交叉，給中醫藥的發展增添新思想和新技術，同時減少了實驗工作量和實驗成本[4]。趕黃草具有保肝的作用，但是其揮發油的藥理作用的機制尚未研究全面。本研究基于分析化學結合計算機輔助藥物設計探討趕黃草揮發油在保肝上的應用，為趕黃草產品開發提供理論依據。

分子對接(molecular docking)可以解釋活性成分與靶標的作用機制，從空間結構上揭示化合物結構-活性關系(structure-aactivity relationship，SAR)[5]，最終目標篩選出關鍵活性成分及靶點，為藥理、細胞和動物實驗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：趕黃草(PenthorumchinensePursh)采自四川瀘州古藺，經貴陽中醫學院藥學院魏升華教授奠定為扯根菜屬PenthorumGronov.ex L.植物扯根菜PenthorumchinensePursh的干燥地上部分，密封室溫放置樣本室，編號為201812005，備用。

試劑：正己烷(南京復優化工貿易有限公司，色譜純)；無水硫酸鈉(上海弘順生物科技有限公司)。

儀器：電熱套(KDM-2000，江蘇杰瑞爾電器有限公司)；氣質聯用儀(Agilent 6890/5975C，美國Agilent公司)；電子天平 (UX2200H，日本島津公司)；揮發油提取器(廈門海標科技有限公司)；LK-400A搖擺式中藥粉碎機(LK-400A，上海隆拓儀器設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 趕黃草揮發油的提取及樣本處理

趕黃草(四川瀘州)揮發油基于水蒸氣蒸餾法(steam distillation，SD)提取，取干燥的趕黃草100 g，粉碎，置于2 L 圓底燒瓶中，混合均勻，連續提取5 h，得到具有芳香氣味的透明油狀液體 1.8 mL，經無水 Na2SO4干燥，備用[6]。

1.2.2 趕黃草揮發油成分的GC-MS 分析

取一定量的揮發油樣品，采用HP6890/5975C GC/MS聯用儀(美國安捷倫公司)進行GC-MS分析。

色譜柱為FB-5MSI(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 彈性石英毛細管柱，初始溫度48 ℃(保留2 min)，以4 ℃/min升溫至220 ℃，再以15 ℃/min升溫至310 ℃，保留5 min，運行時間：56 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流，分流比20∶1，溶劑延遲時間：5.0 min。

離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1 659 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～450 amu。組分質譜數據采用NIST庫進行定性分析，峰面積歸一法進行定量分析。

1.2.3 靶標蛋白篩選

趕黃草揮發油9個主要活性成分：香葉基丙酮，金合歡基丙酮，葉綠醇，二十三烷，二十四烷，二十五烷，二十六烷，二十七烷，2-硬脂酸單甘油酯靶點篩選基于SwissADME(http://www.swissadme)在線分析，每個活性成分預測出15個關鍵靶標蛋白[7,8]，包括蛋白名稱、基因名稱、基因ID等等。

1.2.4 生物功能分析

靶點GO功能分析基于DAVID 6.8(DAVID 6.8，https://david.ncifcrf.gov/)在線分析，將70個靶點導入DAVID數據庫，點擊限定物種為人源，設定閾值P<0.01，GO(Gene Ontology)注釋分析包含，即生物過程 (biological process，BP)、細胞組分 (cellular component，CC)以及分子功能 (molecular function，MF)。

1.2.5 Hub靶點篩選

基于Cytoscape3.5.1中的Cytohubba模塊[9，10]，依據度(degree)，邊過濾成分(edge percolated component，EPC)，最大鄰居組件(maximum neighborhood component，MNC)，最大團中心性(maximal clique centrality，MCC)四種算法輸出hub基因。

1.2.6 疾病分析

將篩選出的hub基因進行疾病分析，基于CTD(comparative toxicogenomics database)在線分析，以“CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB”為關鍵詞分別檢索相關疾病，選擇已經有實驗驗證的 “T”的疾病進行分析。

1.2.7 分子對接驗證分析及關鍵氨基酸位點

CNR1從蛋白質晶體結構數據庫RCSB(http://www.rcsb.org/pdb) 獲取 3D 晶體結構，PDBID：5U09，晶體結構在2.6?的解象下以X衍射的方法獲得。采用Surflex-Dock 模塊完成分子對接(標準模式)[11]，其他參數均采用 Sybyl默認值，以 Total-Score 大于6為閾值，挑選對接效果好的化合物[12]。基于Ligplot 1.4.5軟件進行相互作用分析，結果以氫鍵、疏水作用輸出，篩選關鍵的氨基酸位點。

1.2.8 關鍵化學成分的ADME/T性質

基于SwissADME(http://www.swissadme.ch/)進行初期藥物開發毒性篩選。相關參數包括： CYP450酶的抑制性(cyp inhibitory promiscuity)、氫鍵供體數(h-bond donors,HBD)、氫鍵受體數(h-bond acceptors,HBA)、可旋轉鍵數(rotatable bonds，RBN)、分子量(molecular weight，MW)、脂水分配系數(mlogp)等。

2 實驗結果

2.1 揮發油化學成分

從GC-MS 分析結果(表1)可知，趕黃草揮發油共檢測出31種活性成分，占總峰面積的69.539%，主要化學成分有為香葉基丙酮(2.672%)，金合歡基丙酮(31.907%)，葉綠醇(2.392%)，二十三烷(4.01%)，二十四烷(5.487%)，二十五烷(5.04%)，二十六烷(3.552%)，二十七烷(2.621%)，2-硬脂酸單甘油酯(3.26%)，占總峰面積的62.733%，主要化學成分mol2結構基于TCSMP(中藥系統藥理學數據庫和分析平臺)進行下載[13,14]，圖1為趕黃草揮發油主要活性成分(相對含量>2%)離子流圖。

圖1 揮發油主成分總離子流色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of main components of volatile oil注：10.香葉基丙酮；15.金合歡基丙酮；19.葉綠醇；21.二十三烷；22.二十四烷；23.二十五烷；24.二十六烷；25.二十七烷；26.2-硬脂酸單甘油酯。Note:10.Geranylacetone;15.Farnesylacetone;19.Phytol;21.Tricosane;22.Tetracosane;23.Pentacosane;24.Hexacosane;25.Heptacosane;26.2-Monostearin.

表1 揮發油化學成分

續表1(Continued Tab.1)

編號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Molecular formula分子量Molecular weight相對含量Relative percent (%)2349.31二十五烷 PentacosaneC25H523525.042450.01二十六烷 HexacosaneC26H543663.5522550.65二十七烷 HeptacosaneC27H563802.6212650.822-硬脂酸單甘油酯 2-MonostearinC21H42O43583.262751.23二十八烷 OctacosaneC28H583941.2092851.45角鯊烯 SqualeneC30H504100.6072951.82二十九烷 NonacosaneC29H604081.7683052.46三十烷 TriacontaneC30H624220.5223153.18三十一烷HentriacontaneC31H644370.36Total69.539

2.2 GO功能注釋分析

香葉基丙酮，金合歡基丙酮，葉綠醇，二十三烷，二十四烷，二十五烷，二十六烷，二十七烷，2-硬脂酸單甘油酯9個關鍵活性成分共篩選出135個靶標蛋白，去掉重復靶標蛋白，共有70個靶標蛋白，基于DAVID對70個潛在靶點的GO功能注釋分析[15]，如表2、圖2所示，在生物過程中，70個靶點基因主要參與肽-酪氨酸脫磷酸化(peptidyl-tyrosine dephosphorylation)、血小板激活(platelet activation)等生物過程；主要分布在質膜(plasma membrane)、內質網(endoplasmic reticulum)等；分子功能上，靶點基因主要有蛋白質激酶c活性(protein kinase C activity)、蛋白質酪氨酸磷酸酶活性(protein tyrosine phosphatase activity)、蛋白質激酶結合(protein kinase binding)等功能。

表2 潛在靶點的GO功能注釋分析

續表2(Continued Tab.2)

GO注釋GO annotation 編號No.名稱Name百分比Percentage (%)P-value7Growth cone7.28.77E-048Integral component of membrane46.40.00139Perinuclear region of cytoplasm130.0019分子功能10Mitochondrial membrane5.80.005Molecular function1Glucuronosyltransferase activity131.82E-132Protein kinase c activity10.11.66E-113Transferase activity, transferring hexosyl groups8.71.20E-074Protein tyrosine phosphatase activity11.61.49E-075C-c chemokine receptor activity5.81.34E-056Protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity7.21.44E-057Protein kinase binding14.51.89E-058Chemokine receptor activity5.84.08E-059Calcium-independent protein kinase c activity4.34.78E-0510Calcium-dependent protein kinase c activity4.39.54E-05

圖2 潛在靶點的GO生物學過程富集分析Fig.2 GO biological process enrichment analysis of potential targets

2.3 Hub靶點分析

70個共有差異表達基因通過STRING進行相互作用分析，通過 Cytoscape3.5.1中的cytoHubba中的 epc，degree，mcc，mnc四種算法輸出前10個hub基因(表3)，通過取交集的方法獲取共有6個hub靶點(CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB)。

2.4 化學成分-靶點-疾病分析

Hub靶點通過CTD篩選參與的關鍵疾病，通過化學成分-靶點-疾病分析(表4)，我們發現趕黃草揮發油活性成分2-硬脂酸單甘油酯、香葉基丙酮、金合歡基丙酮在肝硬化、肝炎和非酒精性脂肪肝疾病中發揮重要作用。

表3 Hub基因篩選

2.5 關鍵活性成分分子對接分析及相互作用分析

大麻素受體1(cannabinoid receptor 1，CNR1)為香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮共有靶標蛋白，采用分子對接進行驗證，CNR1具有3個原配體(SO4，PEG，7DY)，利用Docking 模塊分別以SO4，PEG，7DY作為模板形成結合口袋，對接結果以-log10 為單位模擬結合能力，配體與受體結合穩定性以Total Score 值的大小來評價，Total Score越大越穩定。結果發現3個活性成分與PEG，7DY原配體為模板形成結合口袋具有較好的結合，三個活性成分的Total score(TS)>6。

香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮與CNR1(PEG)相互作用有很大的相似性，結構比對顯示Val228，Phe237，Ala236等氨基酸殘基相對位置相同，氨基酸類型相同(表5)。香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮與CNR1(7DY)相互作用有很大的相似性，結構比對顯示Val196，Cys386，Ile105等氨基酸殘基相對位置相同，氨基酸類型相同(表6)。我們可以推測這些殘基就是我們要尋找的CNR1重要殘基。

2.6 關鍵化學成分的理化性質

將2-硬脂酸單甘油酯、香葉基丙酮、金合歡基丙酮進行ADMET性質分析。CYP450酶的抑制性：低抑制(low)和高抑制(hight)；根據Lipinski規則，小分子應該具備氫鍵供體數≤5，氫鍵受體數≤10，可旋轉鍵數≤10，-2.5≤ Log Po/w(mlogp)≤4.15，MW≤500 g/mol，如果過多參數不符合，會影響藥物的溶解性及腸吸收能力，2-硬脂酸單甘油酯、香葉基丙酮、金合歡基丙酮基本遵循Lipinski規則(表7)。

表5 關鍵活性成分與大麻素受體1(PEG)相互作用分析

表6 關鍵活性成分與大麻素受體1(7DY)相互作用分析

表7 關鍵化學成分理化性質

3 結論

本研究基于網絡藥理學及分子對接技術揭示了趕黃草揮發油化合物結構-活性關系，鑒定出31個活性成分，關鍵活性成分共篩選出70個靶標蛋白。6個hub靶點(CNR2，CNR1，CCR5，CCR3，PRKCA，PRKCB)，3個主要保肝活性成分：香葉基丙酮，2-硬脂酸單甘油酯，金合歡基丙酮。研究結果初步篩選出趕黃草揮發油保肝的關鍵靶點及活性成分，為趕黃草揮發油保肝機理解釋提供理論依據。

本次研究中發現趕黃草揮發油可能通過調節大麻素受體2(cannabinoid receptor 2,CNR2)，大麻素受體1(cannabinoid receptor 1,CNR1)，C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor type 5，CCR5)，C-C趨化因子受體3(C-C chemokine receptor type 3,CCR3)，蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PRKCA)，蛋白激酶Cβ(protein kinase Cβ，PRKCB)防治肝硬化、肝炎和非酒精性脂肪肝等肝臟疾病。大麻具有重要的藥用價值，其活性化合物為大麻素，人體體內存在兩種大麻素受體[16,17]。大麻素系統紊亂可導致機體代謝、免疫系統、心血管系統、神經系統、消化系統等疾病。CNR1是脂質類內源性大麻素信號系統的主要受體，在腦發育、脂肪代謝平衡和神經系統功能障礙等機制中發揮著重要作用[18,19]。通過相互作用驗證分析發現香葉基丙酮、2-硬脂酸單甘油酯、金合歡基丙酮與CNR1作用的氨基酸位點有較大的相似性，這些關鍵的氨基酸位點可能與趕黃草揮發油的藥效作用密切相關。

本研究建立了快速篩選揮發油活性成分藥理作用的方法，能夠快速篩選出藥理作用的關鍵靶點及活性成分，打破了傳統的揮發油抗氧化、抗菌等方面的體外研究，為揮發油藥理作用的評價提供新的思路，為其揮發油產品開發提供理論指導。因此，基于分子對接技術揭示化合物結構-活性關系，更具準確性和針對性，可以加快物質基礎研究效率，同時能有效闡明有效成分-作用靶點的相關性，為其中藥多成分、多效應的科學本質提供新的研究思路。