巢湖半湯溫泉中菌株CHBT-1721產淀粉酶性質初步研究

方 舒，嚴 鵬，周培培

（巢湖學院化學與材料工程學院，安徽巢湖238000）

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，是一種能使糖原水解和催化淀粉轉化為葡萄糖、麥芽糖等糖類及一系列其它低聚糖的酶類，能使淀粉分子中的α-1,4糖苷鍵或β-1,6糖苷鍵發生水解[1-3]。淀粉酶大部分存在于微生物和動植物中，其中微生物的酶幾乎都是分泌的，為酶液的分離提供了便利[4]。淀粉酶制劑是最早實現工業化生產的酶制劑，產量最多，廣泛應用于食品加工、發酵工業、醫藥行業、釀造產業、化學工藝、飼料工業等多種領域[5-7]。淀粉酶是一種生物活性催化劑，需要在特定的溫度、pH等條件下才能正常發揮酶活性，為了提高淀粉酶活性，保障較高的淀粉轉化效果，研究淀粉酶的反應條件對淀粉酶的工業化應用具有重要的意義[8-9]。最早實現工業化生產的酶制劑由于淀粉的糊化溫度較高，使用的淀粉水解酶一般均需要耐受較高的溫度。溫泉是篩選嗜熱菌的微生物資源庫，從中篩選具有產耐熱淀粉酶的細菌幾率很大，我國科學家通過對云南騰沖溫泉中嗜熱微生物資源的多樣性研究，已篩選出大量有應用價值的耐熱型細菌[3,10-13]。

安徽巢湖半湯溫泉系全國四大溫泉之一，大小泉眼，星羅棋布。最大的有兩口，一為燙泉，一為冷泉，兩泉匯合為溫泉，故名“半湯”。其中熱泉水溫60℃，日流量1 000噸左右，冷泉水溫40℃，日流量10 000多噸。

本研究擬對之前實驗室篩選自巢湖半湯溫泉的一株產淀粉酶的嗜熱菌株CHBT-1721進行初步的酶學性質研究，為后期的工業化應用提供一定的科學依據[14]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

實驗室保藏的一株篩選自巢湖半湯溫泉中的嗜熱菌株CHBT-1721。

1.1.2 培養基

產淀粉酶培養基（g/1 000 mL）：蛋白胨10，牛肉膏5，可溶性淀粉2，NaCl 5，蒸餾水1 000 mL，調節pH為7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，上述培養基中加入15～20 g瓊脂粉即制成產淀粉酶固體培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化

在超凈工作臺上用滅菌后的接種環將斜面保藏的菌株CHBT-1721經平板劃線法接種到平板上，放入50℃的恒溫培養箱中倒置培養[15]。24 h后向平板的表面滴加少量盧戈氏碘液，混勻、若菌落的周圍觀察到無色透明的水解圈，說明淀粉被水解了，則該菌株已被活化并且是產淀粉酶菌株[16-17]。活化后的菌株CHBT-1721通過斜面傳代法短期保藏于-4℃冰箱中，備用。

1.2.2 淀粉酶活力的測定

淀粉酶活力的測定采用DNS比色法，淀粉酶催化產生的還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸，淀粉酶活力的大小與產生的還原糖的量成正比。用標準濃度的麥芽糖溶液制作標準曲線，用比色法測定淀粉酶用于淀粉后生成的還原糖的量，以單位樣品在一定時間內生成的麥芽糖的量表示酶活力[18]。

1.2.2.1 麥芽糖標準曲線的制作

麥芽糖標準曲線的制作按照表1進行。

表1 標準麥芽糖溶液吸光度值的測定

1.2.2.1 粗酶液的制備

無菌操作接種少量菌株CHBT-1721到100 mL產淀粉酶液體培養基中，120 r/min恒溫振蕩培養，48 h后將上述菌液轉移到離心管中，4 000 r/min離心20 min，取上清液保存于潔凈離心管中，-20℃保藏備用，即為粗酶液。

酶活定義：上述條件下以單位體積樣品在30 min釋放1 mg麥芽糖所需的酶量為一個麥芽糖單位（MMU）表示酶活性。

1.2.3 粗酶液活性與溫度、pH、金屬離子和茶堿的關系

在波長為520 nm的條件下用分光光度計測定菌株CHBT-1721所提取粗酶液在溫度（30，35，40，45，50，55，60）℃、pH（3，4，5，6，7，8，9，10，11）、金屬離子（Zn2+、Mg2+、K+、Fe2+、Cu2+）和茶堿（3，6，9，12）mmol/L下的吸光度值，并根據公式計算各研究條件下的淀粉酶活力，繪圖。

2 結果與分析

2.1 淀粉酶活力的測定

2.1.1 麥芽糖標準曲線的繪制

根據實驗原理，利用不同濃度的麥芽糖與3,5-二硝基水楊酸的顯色反應測得在波長為520 nm下的吸光度值，并以吸光度值為縱坐標，麥芽糖含量為橫坐標作圖1，即為麥芽糖標準曲線圖，公式為：

y=0.4893，x-0.0434，R2=0.9935。

圖1 麥芽糖標準曲線

2.1.2 淀粉酶活力

表2 酶活力測定

2.2 酶學性質研究

2.2.1 溫度對酶活力的影響

由圖2可知淀粉酶活力的最適溫度范圍為40～50℃，淀粉酶最適反應溫度是45℃，且溫度高于60℃時，酶活力急劇下降。

2.2.2 pH值對酶活力的影響

由圖3可知淀粉酶活力的最適pH范圍為6～8，淀粉酶最適pH是7，符合淀粉酶是胞內酶的定性。

2.2.3 金屬離子對酶活力的影響

由圖4可以看出在2 mmol/L濃度下的金屬離子對淀粉酶活性的影響，Mg2+、K+均對淀粉酶活性有促進作用，而K+的促進作用最大，Zn2+、Cu2+、Fe2+均對淀粉酶活性有抑制作用，而Zn2+的抑制作用最明顯。

2.2.4 茶堿對酶活力的影響

由圖5可以看出茶堿對淀粉酶有抑制作用，且隨著濃度的增加而增強。

圖2 不同溫度下的相對酶活

圖3 不同pH值下的相對酶活

圖4 不同金屬離子下的相對酶活

圖5 不同濃度茶堿下的相對酶活

3 結論

該研究對實驗室保藏的一株產淀粉酶嗜熱菌株CHBT-1721的酶學性質進行了初步研究，菌株CHBT-1721的淀粉酶活性受到溫度、pH值、金屬離子、茶堿因素的影響。實驗結果表明，溫度和pH值對淀粉酶活性的影響非常顯著，最適溫度和最適pH值的測定對酶的應用研究具有重要的意義。不同菌株的生長溫度不同，其所產淀粉酶的最適反應活性溫度也是不一樣的，淀粉酶活性的最適pH值受酶來源影響，一般細菌來源的淀粉酶活性的pH值范圍是6～7[19]。另外不同金屬離子對淀粉酶的活性也有影響，該研究中，K+、Mg2+均有促進作用，Fe2+抑制作用較弱，Cu2+、Zn2+抑制明顯，推測Cu2+、Zn2+可以破壞酶蛋白質的結構。茶堿是黃嘌呤甲基衍生物，是一類具有顯著生理作用的生物堿存在于茶葉中，本研究中發現茶堿隨著濃度的增加，其抑制淀粉酶活性的作用逐漸增加，這與劉雯等[20]的研究結果也是一致的。

菌株CHBT-1721所產淀粉酶的反應條件溫和適合工業生產，不僅對淀粉酶庫有了進一步擴充，而且使淀粉酶工業生產多了一種選擇。后續擬對該酶的蛋白質結構與基因表達進行研究，使該酶能適應復雜的工業環境，提高該酶的應用價值。