雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051對HEL細胞周期及分化的影響*

劉務玲， 姚堯， 陳娟， 吳昌學， 宋晶睿， 王春林， 邱劍飛， 王立平， 朱偉明,3， 龍群**， 李艷梅**

(1.貴州省中國科學院 天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014； 2.貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550025； 3.中國海洋大學， 山東 青島 266100)

白血病(leukemia)是危害人類健康的惡性血液疾病[1]，美國癌癥協會預測2019年美國將有22 846人死于白血病，并且白血病仍會是第六大癌癥[2]。目前，白血病的主要治療方法是化療和放療[1]，但白血病細胞對化療藥物的耐藥性是臨床治療的主要障礙[3]。因此，探索新的白血病化療藥物具有重要的醫學意義。已有研究顯示，誘導細胞分化可作為一種有效抑制多種癌癥細胞的新思路[4-5]，且細胞周期檢查點抑制劑對白血病、實體腫瘤有一定的治療效果[6]，這使通過細胞分化和細胞周期阻滯途徑抑制癌細胞增殖的化合物有著重要的應用前景。1982年，Martin等[7]科學家首次報道從白血病病人外周血中分離并建立了HEL(human erythroleukemia)細胞系，自此HEL細胞系作為人白血病細胞模型廣泛用于科學研究[8-11]。雙吲哚馬來酰亞胺及其衍生物主要用于抑制蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[12-13]，但雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051(簡稱化合物GZWM-051)對白血病細胞的周期及分化的影響未見報道。因此，本研究就化合物GZWM-051對HEL細胞系的周期及分化的影響進行探討，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1細胞、藥物和試劑 人紅白血病HEL細胞系為貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室保存。化合物GZWM-051由中國海洋大學朱偉明教授課題組設計合成，相對分子量為638，純度95%以上。細胞分化抗體CD61、CD41a、CD235a、CD71購自美國Thermo Fisher公司，PBS緩沖液、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、細胞周期碘化丙啶(propidium iodide, PI)染料及RNAase及試劑購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜購于美國Bio-Rad公司，蛋白內參(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、c-Myc、Cyclin B1、STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)、P-STAT3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3)抗體購自美國Abcam公司，熒光標記抗兔二抗購自美國CST公司。

1.1.2主要儀器 Microfuge 20R冷凍離心機購自美國Beckman公司，SDS-PAGE電泳轉膜儀購自美國Bio-Rad公司產品，Synergy2酶標儀購自美國Bio-Tek公司，NovoCyte 2040R流式細胞儀購自杭州安捷倫生物有限公司，Odyssey CLX雙色紅外激光成像系統購自美國LI-COR公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞周期測定 取2×106個對數生長期細胞，鋪于6孔板中，分別加入0.025、0.050、0.100 μmol/L化合物GZWM-051作為低劑量、中劑量和高劑量組，以DMSO為對照組；作用24 h后，用離心管收集細胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清液；用PBS輕輕沖洗細胞，洗3次；接著1 500 r/min離心5 min，棄上清液；加入75%乙醇1 mL固定細胞，置-20 ℃固定處理過夜；取出樣品1 500 r/min離心5 min去除乙醇上清液，用PBS洗滌細胞后去除上清液；加入500 μL的 PBS重懸細胞，轉移至1.5 mL離心管中，加入RNAase酶、PI染液使其終濃度分別為100 mg/L和50 mg/L；輕輕混勻，置37 ℃避光處理1 h；用1 mL的PBS洗滌細胞1次，并1 500 r/min離心5 min，棄上清液；用適量PBS重懸細胞沉淀，后用流式細胞儀檢測并分析HEL細胞周期分布。

1.2.2細胞分化分析 收集生長狀態良好的細胞，放入離心機1 500 r/min離心5 min，棄去上清液；用培養基重懸細胞，進行細胞計數后，鋪6孔板，每孔2×106個；加入1.2.1項下化合物GZWM-051低、中、高劑量作用48 h，用離心管收集細胞，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液；用PBS重懸細胞，進行細胞計數后，調整細胞密度至1×1010個/L；取100 μL轉移至1.5 mL離心管，加入分化抗體進行染色：對于巨核分化檢測，加入CD61-APC抗體及CD41a-FITC抗體各2 μL至細胞懸液；對于紅系分化檢測，則加入CD235a-APC抗體及CD71-FITC抗體各2 μL至細胞懸液；加入分化抗體后混勻，置冰上染色1 h，用流式細胞儀進行檢測并分析HEL細胞CD61、CD41a、CD235a及CD71的百分比分布。

1.2.3Western blot測定 取2×106個對數生長期穩定生長細胞，鋪于6孔板中，加入1.2.1項下化合物GZWM-051低、中、高劑量，同時以DMSO為對照組；處理48 h，收集細胞，加入適量蛋白裂解液置于冰上作用30 min，12 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，棄去沉淀。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃蛋白變性5 min，置于超低溫冰箱備用；進行SDS-PAGE凝膠電泳分離(100 V恒壓，2 h)，將PVDF膜置于甲醇中激活1 min，放入1×轉膜緩沖液浸潤后轉膜(220 mA恒流，2 h)；用5%脫脂牛奶進行封閉1 h，一抗孵育過夜；完成一抗孵育后洗膜3次，二抗孵育1 h后洗膜3次，用雙色紅外熒光成像系統檢測和分析HEL細胞的蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞周期

流式細胞術檢測結果顯示，處理24 h后，與對照組HEL細胞相比，化合物GZWM-051中、高劑量組 HEL細胞處于G1和S期細胞數量顯著減少，處于G2期的數量顯著增加，差異有高度統計學意義(P<0.01)。見圖1、圖2。

圖1 化合物GZWM-051促使HEL細胞G2期阻滯Fig.1 G2 phase arrest induced by compound GZWM-051

注：(1)與DMSO組比較，P<0.01。圖2 化合物GZWM-051處理24 h后HEL細胞周期分布Fig.2 The effect of GZWM-051 on different phrases of cell cycle

2.2 細胞分化

流式細胞術檢測結果顯示，相比對照組，作用48 h化合物GZWM-051低、中、高劑量組HEL細胞的CD41a和CD71均上調。見圖3。

2.3 Cyclin B1、c-Myc、STAT3及P-STAT3蛋白表達水平

Western blot檢測結果顯示，與對照組HEL細胞對比，中劑量化合物GZWM-051及高劑量化合物GZWM-051組HEL細胞生長相關蛋白c-Myc表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與對照組HEL細胞對比，低化合物GZWM-051、中化合物GZWM-051及高劑量的化合物GZWM-051組HEL細胞的P-STAT3表達水平降低(P<0.05或P<0.01)，中、高劑量化合物GZWM-051組HEL細胞周期蛋白Cyclin B1表達水平降低(P<0.05)。見圖4。

圖3 化合物GZWM-051誘導HEL細胞分化Fig.3 The effect of compound GZWM-051on HEL cell differentiation

注：A為Western blot檢測結果，B為蛋白相對表達水平直條圖；與DMSO組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 化合物GZWM-051對HEL細胞Cyclin B1、c-Myc、STAT3及P-STAT3蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of compound GZWM-051 on the expression levels of Cyclin B1、c-Myc、STAT3 and P-STAT3

3 討論

為了探索不同濃度化合物GZWM-051對HEL細胞的作用效果，本研究檢測低劑量(0.025 μmol/L)、中劑量(0.050 μmol/L)、高劑量(0.100 μmol/L)3種濃度對HEL細胞的周期、分化及相關蛋白表達水平的影響。結果顯示，化合物GZWM-051低、中、高劑量組HEL細胞的CD41a陽性率均高于對照組，這表明化合物GZWM-051誘導HEL細胞向巨核分化。中、高劑量化合物GZWM-051處理組CD71陽性率高于對照組，表明化合物GZWM-051誘導HEL細胞向紅系分化。正常血細胞在骨髓中增殖、分化并成熟，然后進入血液發揮作用，所以大部分血細胞處于高度分化的狀態，其蛋白合成及細胞分裂能力較低，壽命大多很短，如中性粒細胞只有幾小時，血小板只有幾天，紅細胞只有幾周[14]。然而，大部分癌癥細胞尤其是白血病細胞，在細胞成熟的不同階段分化被阻斷而保持未分化狀態[15]。因此，誘導癌細胞分化可改變癌細胞的干細胞特征，抑制其惡性增殖。分化療法是用小劑量的化合物誘導癌細胞分化，將惡性癌癥細胞及無用的細胞重新分化成為功能細胞，這被認為是誘導癌細胞死亡和增殖抑制的一種新思路[14,16-17]。相比其他癌癥治療方法，分化療法可以降低細胞化療帶來的毒副作用，更重要的是可以提高完全緩解和治愈率，且不易產生耐藥性[15,18]。化合物GZWM-051處理組HEL細胞的紅細胞標志物CD41a及巨核細胞標志物CD71增多，意味著化合物GZWM-051促使HEL細胞發生紅系及巨核分化，從而抑制其惡性增殖。因此，該化合物有重要的潛在臨床應用價值。許多抗癌藥物都能在特定的檢查點阻滯細胞周期，從而導致分裂停止[19]。抑制細胞周期已成為抑制癌癥進展中最常見的方法之一，已報道的一些化合物可以通過誘導G2周期阻滯進而抑制腫瘤細胞的增殖[20-22]。本研究檢測結果顯示，處理24 h后，與對照組HEL細胞相比，化合物GZWM-051中、高劑量組HEL細胞處于G1和S期細胞數量顯著減少，處于G2期的數量顯著增加(P<0.01)，這表明化合物GZWM-051誘導HEL細胞阻滯于G2期，從而抑制細胞分裂與增殖。STAT3是STAT蛋白家族中的一員[23]。在細胞因子和生長因子的作用下，STAT3被受體相關的Janus激酶(janus kinase, JAK)磷酸化，并轉移到細胞核中，在細胞核中發揮轉錄激活劑的作用[23]。STAT3介導多種基因在細胞刺激反應中的表達，在細胞生長、凋亡等細胞過程中發揮著關鍵作用[24-26]。有報道指出，一些影響癌癥進展的microRNA，如miR-337-3、miR-17-5p及miR-20a等，通過調控JAK/STAT3信號通路發揮作用[27-28]。JAK/STAT3信號通路還在促進腫瘤干細胞自我更新和分化過程中扮演重要角色[29-30]。不僅如此，STAT3還可通過調控線粒體功能及表觀遺傳影響癌癥進展[24]。因此，可以認為STAT3是癌癥治療的重要靶點。本研究中化合物GZWM-051下調P-STAT3蛋白表達水平(P<0.05)，推測其抑制STAT3所在信號通路，從而抑制細胞生長。此外，Cyclin B1對細胞發育至關重要，細胞有絲分裂必須從細胞核中釋放Cyclin B1，以防止細胞過早進入有絲分裂[31]。本研究顯示化合物GZWM-051可顯著下調Cyclin B1表達水平(P<0.05)，從而抑制細胞的分裂。c-Myc通常在癌癥組織中表達，并引起許多參與細胞增殖及有助于癌癥形成的基因表達增加[32-33]。化合物GZWM-051顯著下調c-Myc的表達水平(P<0.05或P<0.01)，從而進一步抑制細胞分裂。

綜上所述，化合物GZWM-051不僅能誘導白血病HEL細胞發生G2周期阻滯，促進其向巨核及紅系進行分化，抑制細胞惡性增殖，還能失活STAT3關鍵通路。因此，化合物GZWM-051是良好的治療癌癥的潛在化合物。