七氟醚預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠海馬血管緊張素Ⅱ-2受體及炎癥的影響*

秦起， 李芮， 曾慶繁 ***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.十堰市太和醫(yī)院 麻醉科, 湖北 十堰 442000)

腦缺血再灌注損傷是腦組織在缺血一定時(shí)間的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后損傷加重、甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象，近年來(lái)對(duì)其損傷機(jī)制及藥物保護(hù)的研究已取得進(jìn)展[1-3]。七氟醚是臨床常用的吸入麻醉藥，研究表明七氟醚預(yù)處理可以明顯減輕腦缺血再灌注損傷，但是具體機(jī)制尚不清楚[4-6]。文獻(xiàn)報(bào)道腦內(nèi)分布有血管緊張素Ⅱ-2受體(Angiotensin Ⅱ-2 Receptor，AT2R)，AT2R激活后可以通過(guò)改善血液灌注、抗炎、神經(jīng)恢復(fù)及再生等過(guò)程來(lái)保護(hù)腦組織[7-8]。本研究擬探討七氟醚預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用是否與激活腦AT2R及抗炎作用有關(guān)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

七氟醚(批號(hào)79111，美國(guó)艾伯維公司)，AT2R拮抗劑PD123319(美國(guó)MCE公司)，線(xiàn)栓(北京西濃科技有限公司)，TTC (美國(guó)Sigma公司)，AT2R抗體(美國(guó)abcam公司)，GAPDH單克隆抗體(美國(guó)Proteintech公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(美國(guó)Proteintech公司)，TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒(上海欣博盛科技有限公司)，BCA蛋白測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。麻醉呼吸機(jī)及麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組與處理

8～10周齡、體質(zhì)量260～280 g的健康雄性SD大鼠80只，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)SCXK(黔)2018-001]，隨機(jī)均分成假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注損傷組(IR組)、七氟醚+腦缺血再灌注損傷組(SP組)、AT2R拮抗劑+七氟醚+腦缺血再灌注損傷組(SPD組)及AT2R拮抗劑+腦缺血再灌注損傷組(PD組)。5組大鼠給予2.5%七氟醚和2 L/min的氧氣吸入麻醉1 h、連續(xù)5 d，SPD組和PD組同時(shí)分別注射腹腔注射AT2R阻斷劑1 mL (1 mg/kg)、5 d，其余3組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水；最后一天(第5天)麻醉和給藥后24 h，IR組、SP組、SPD組及PD組大鼠制作腦缺血再灌注損傷模型，Sham組大鼠只分離頸總動(dòng)脈不接扎。

1.3 七氟醚預(yù)處理

將需要麻醉的SP組、SPD組大鼠置于透明的密閉塑料麻醉箱(50 cm×30 cm×30 cm)，箱底鋪一層鈉石灰,將取暖器置于箱旁60 cm，維持鼠肛溫36～37 ℃。進(jìn)氣口吸入2.5 %的七氟醚和2 L/min的氧氣1 h/d、連續(xù)5 d。出氣口接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀和廢氣回收罐,檢測(cè)七氟醚、CO2及O2濃度,其它組在相應(yīng)時(shí)間只吸入2 L/min的氧氣,直至麻醉結(jié)束。麻醉過(guò)程中保持自主呼吸,密切觀(guān)察監(jiān)護(hù)儀及鼠皮膚顏色和呼吸幅度，麻醉結(jié)束后待大鼠自然清醒后放回鼠籠中。

1.4 腦缺血再灌注損傷模型制備

參照Longa等[9-10]改良的使用線(xiàn)栓阻塞大腦中動(dòng)脈的方法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型。10%的水合氯醛 (350 mg/kg) 腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥固定、消毒，右側(cè)頸部旁正中縱行切口，依次分離出頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，縫線(xiàn)結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，動(dòng)脈夾臨時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端后，離頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處5 mm處作一切口，從切口處向頸內(nèi)動(dòng)脈插入線(xiàn)栓，輕微的突破感為止(18 mm左右)，線(xiàn)栓固定后縫合傷口，實(shí)施大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血，2 h后稍微向外拔出線(xiàn)栓實(shí)施再灌注。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NDS評(píng)分) 參照Longa神經(jīng)評(píng)分法，在局灶性腦缺血-再灌注24 h后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試評(píng)分。NDS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)神經(jīng)功能缺損計(jì)0分，輕度神經(jīng)功能缺損(不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢)計(jì)1分,中度神經(jīng)功能缺損(向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈)計(jì)2分,重度神經(jīng)功能缺損(向?qū)?cè)傾倒)計(jì)3分，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低計(jì)4分。

1.5.2腦梗死體積測(cè)定 大鼠再灌注24 h后，各組隨機(jī)選取5只。水合氯醛麻醉后迅速處死斷頭冰上取腦,置于-20 ℃冰箱20 min后切除額極與枕極,沿冠狀面均勻切5片，置于2%的TTC染色液中，37 ℃溫箱避光孵育30 min，中間每隔5 min輕輕翻動(dòng)腦片，使其均勻著色，4%多聚甲醛4 ℃冰箱固定24 h。數(shù)碼相機(jī)拍照照片輸入Image-ProPlus6.0圖像分析軟件測(cè)梗死體積，各腦片梗死體積之和乘以厚度(2 mm)即為梗死體積，以梗死體積占全腦體積百分比反映腦梗死體積。

1.5.3AT2R蛋白含量測(cè)定 再灌注24 h后，水合氯醛麻醉后迅速斷頭處死冰上剝離海馬組織,從海馬組織中提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)蛋白濃度后，用PBS調(diào)整蛋白樣品濃度與上樣緩沖液等體積混合，100 ℃煮沸10 min，冷卻后用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。加入AT2R(1 ∶2 000)和 GAPDH (1 ∶5 000)抗體,4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗膜后加入二抗(1 ∶5 000)進(jìn)行孵育。ECL顯色后圖片輸入Image-ProPlus6.0圖像分析軟件。采用AT2R與內(nèi)參GAPDH的灰度值的比值來(lái)反映AT2R含量。

1.5.4海馬組織炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量測(cè)定 從-80 ℃冰箱取出新鮮海馬組織標(biāo)本，剪碎后加適量PBS(100 mg蛋白加PBS 1 mL)，超聲破碎儀破碎組織后制成勻漿，12 000 r/min離心10 min后取上清，BCA方法測(cè)定蛋白濃度。用ELISA試劑盒測(cè)定大鼠海馬TNF-α和IL-1β含量,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算樣品中TNF-α、IL-1β的濃度，根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織的總蛋白濃度計(jì)算海馬TNF-α、IL-1β的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NDS評(píng)分

與Sham組比較,IR組、SP組、SPD組及PD組NDS評(píng)分明顯升高，SP組NDS評(píng)分明顯低于IR組，SPD組NDS分明顯高于SP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠NDS評(píng)分(n=16)Tab.1 NDS score of rats in 5 groups

注：(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。

2.2 腦梗死體積

與Sham組比較，IR組、SP組、SPD組及PD組腦梗死體積明顯升高，SP組腦梗死體積明顯低于IR組，SPD組腦梗死體積明顯高于SP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：A為T(mén)TC染色，B為腦梗死體積比較的直條圖；(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。圖1 5組大鼠缺血再灌注24 h后腦梗死面積Fig.1 Cerebral infarction area after 24 hours of ischemia-reperfusion in 5 groups of rats

2.3 AT2R蛋白含量

與Sham組比較，IR組、SP組、SPD組及PD組AT2R蛋白含量明顯上調(diào)，SP組AT2R蛋白含量明顯高于IR組，SPD組AT2R蛋白含量明顯低于SP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

注：(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較，P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。圖2 5組大鼠腦缺血側(cè)海馬AT2R相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of AT2R in hippocampus of rats with cerebral ischemia in 5 groups

2.4 TNF-a、IL-1β含量

與Sham組比較,IR組、SP組、SPD組及PD組海馬TNF-a、IL-1β含量明顯上調(diào)；與IR組比較，SP組海馬TNF-a、IL-1β含量明顯降低；與SP組比較，SPD組海馬TNF-a、IL-1β含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠TNF-a、IL-1β含量Tab.2 TNF-a, IL-1 β content in 5 groups of rats

注：(1)與Sham組比較，P<0.05；(2)與IR組比較,P<0.05；(3)與SP組比較，P<0.05。

3 討論

AT2R是一個(gè)由363個(gè)氨基酸編碼組成的7次跨膜蛋白，研究表明腦內(nèi)AT2R受體激活可以通過(guò)激活BDNF、PPAR-γ等多通路，促進(jìn)腦部神經(jīng)細(xì)胞分化、神經(jīng)軸突生長(zhǎng)、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)炎癥、增加腦血流量，抗細(xì)胞凋亡作用，是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性保護(hù)通路之一[11]。在未成熟的大腦，AT2R表達(dá)豐富且分布廣泛，主要集中在與運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、學(xué)習(xí)相關(guān)的中樞區(qū)域及邊緣系統(tǒng)的某些結(jié)構(gòu)如海馬等，在成年大鼠中，這些部位的AT2R顯著減少維持較低水平，但在腦缺血性損傷后AT2R表達(dá)量上調(diào)[12]。文獻(xiàn)報(bào)道在大腦中動(dòng)脈阻塞后，AT2R基因敲除大鼠缺血性腦損傷較野生型(Agtr2 +)更嚴(yán)重[13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷24 h后AT2R才緩慢升高，7 d后達(dá)到高峰；給予AT2R激動(dòng)劑激活A(yù)T2R后，大鼠腦梗死面積減小，神經(jīng)行為障礙明顯得到改善[7]。在本試驗(yàn)中，缺血再灌注24 h后，與Sham組比較,各組AT2R表達(dá)量增加，這與上述成年大鼠AT2R顯著減少維持較低水平，腦缺血性損傷后AT2R表達(dá)量緩慢上調(diào)的研究結(jié)論一致；而經(jīng)過(guò)七氟醚預(yù)處理后的SP組AT2R蛋白表達(dá)量明顯增加，使用了AT2R拮抗劑的SPD組AT2R蛋白表達(dá)量明顯下降，說(shuō)明在缺血-再灌注損傷中，七氟醚預(yù)處理提前激活了腦血管緊張素AT2R的表達(dá)。推測(cè)PD組可能是由于成年大鼠AT2R蛋白維持較低水平以及在缺血-再灌注損傷前腹腔注射1mg/kg的AT2R拮抗劑PD123319劑量偏少的緣故，AT2R蛋白表達(dá)量與IR組、SPD相比無(wú)明顯差異。

本研究采用線(xiàn)栓栓塞大腦中動(dòng)脈制作大鼠腦局灶性腦缺血-再灌注模型，采用缺血2 h，再灌注24 h來(lái)模擬臨床上常見(jiàn)的大腦缺血再灌注損傷，通過(guò)神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和腦梗死體積百分比兩方面來(lái)來(lái)判斷各組腦缺血再灌注損傷的結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與Sham組比較，IR組神經(jīng)功能評(píng)分與腦梗死體積明顯升高，說(shuō)明缺血再灌注損傷模型建立成功。文獻(xiàn)報(bào)道每天吸入2.5%七氟醚1 h、連續(xù)5 d，可明顯減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷，產(chǎn)生腦保護(hù)作用[14]。本試驗(yàn)也采用該方案，研究顯示SP組的腦梗死百分比、神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比IR組明顯降低。說(shuō)明本試驗(yàn)中采用的七氟醚預(yù)處理方案對(duì)缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

一些研究證實(shí)免疫、炎癥反應(yīng)與缺血性損傷有關(guān)，在缺血再灌注損傷后腦組織和血漿中TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子發(fā)生改變[15-17]。在本實(shí)驗(yàn)中除Sham組外，各組大鼠腦缺血再灌注24 h后海馬TNF-α、IL-1β明顯升高，說(shuō)明炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中確實(shí)起著重要作用；與SP組相比，IR組、SPD及PD組TNF-α、IL-1β增加，腦損傷加重，這也說(shuō)明了七氟醚預(yù)處理通過(guò)減輕腦缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生了保護(hù)作用[18]。文獻(xiàn)報(bào)道在大腦中動(dòng)脈阻塞后，給入AT2R激動(dòng)劑C21，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等表達(dá)明顯降低[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，與使用了AT2R阻斷劑的SPD組相比，七氟醚預(yù)處理后的SP組AT2R明顯增加，炎癥因子TNF-α、IL-1β卻降低，說(shuō)明七氟醚預(yù)處理激活了AT2R蛋白，降低了腦的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，七氟醚預(yù)處理減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制可能與提前上調(diào)腦血管緊張素AT2R，進(jìn)而抑制缺血后的急性炎性反應(yīng)有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有對(duì)七氟醚是通過(guò)什么通路激活腦血管緊張素AT2R進(jìn)行研究，AT2R確切的激活機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究[20-21]。七氟醚具有血?dú)夥峙湎禂?shù)(0.63)低，刺激性小，吸收、清除快和麻醉維持可控等優(yōu)點(diǎn)，且在臟器保護(hù)方面有潛在價(jià)值，通過(guò)對(duì)其保護(hù)機(jī)制的進(jìn)一步研究,可以更好地指導(dǎo)圍術(shù)期臟器缺血保護(hù)及臨床治療。