二丁顆粒對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎作用

李天旺，田 鵬，趙 力，姚會(huì)欣，陳金強(qiáng)

（中國人民解放軍第252醫(yī)院，河北 保定 071000）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是40歲以上男性常見炎癥性關(guān)節(jié)疾病，是尿酸單鈉分解引起的關(guān)節(jié)疾病，伴有嘌呤代謝紊亂［1］。痛風(fēng)的進(jìn)展一般分為3個(gè)階段：無癥狀的高尿酸血癥、無癥狀的間歇性痛風(fēng)發(fā)作和無緩解的長期慢性痛風(fēng)［2］。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（AGA）是由于尿酸鹽結(jié)晶沉著于關(guān)節(jié)及周圍組織而引起的急性特征性炎性反應(yīng)［3］，具體作用機(jī)制目前尚不完全清楚。雖然痛風(fēng)患者可能首先抱怨疼痛，但有效治療應(yīng)考慮其潛在炎癥。目前，非甾體抗炎藥（NSAIDs）是痛風(fēng)的主要治療藥物，用于鎮(zhèn)痛和抑制炎癥［4］。其中，吲哚美辛是治療AGA的標(biāo)準(zhǔn)藥物，但不良反應(yīng)多，以胃腸道尤其顯著［5］。二丁顆粒為藥典成方制劑，具有清熱解毒功效［6］，可用于炎癥性疾病的治療。本研究中探討了二丁顆粒對(duì)AGA大鼠抗炎消腫止痛的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：HBS-1096B型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TP1020型組織脫水機(jī)、EG1160型包埋機(jī)、RM2255型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備，均購于德國Leica公司；ML203E型電子天平（上海梅特勒公司）；GL-10000C型高速冷凍離心機(jī)（上海醫(yī)學(xué)儀器廠）；DSX100型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：二丁顆粒（四川大千藥業(yè)公司，批號(hào)為140101）；尿酸鈉（美國Sigma公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.2 造模

動(dòng)物及分組：取健康3個(gè)月齡雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量220～260 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)為SCXK（湘）2009-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。按隨機(jī)數(shù)字表法均分為假手術(shù)組、模型組、吲哚美辛組和二丁顆粒低、中、高劑量組，各10只。

大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)炎模型制備：各組大鼠仰臥固定，剔除右后肢小腿關(guān)節(jié)毛，消毒，麻醉后用6號(hào)注射針以大鼠右深關(guān)節(jié)外側(cè)后方為穿刺點(diǎn)，距小腿關(guān)節(jié)背后從45°方向插入至脛骨肌腱內(nèi)側(cè)，注入3.0%尿酸鈉溶液200 μL，假手術(shù)組給予等量無菌生理鹽水。

干預(yù)：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始給藥，吲哚美辛組灌胃給予3.0 mg/kg吲哚美辛，二丁顆粒低、中、高劑量組分別給予灌胃質(zhì)量濃度為10，20，40 mg/kg的二丁顆粒，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水，持續(xù)給予7 d，在第5天給藥后1 h進(jìn)行造模。

1.3 指標(biāo)測定

關(guān)節(jié)腫脹程度：于造模前1 h和造模后48 h，用周長法測右后肢小腿關(guān)節(jié)同一部位周徑，計(jì)算腫脹度=致炎后小腿關(guān)節(jié)周徑-致炎前小腿關(guān)節(jié)周徑。大鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)觀察：根據(jù)Coderre炎癥指數(shù)分級(jí)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)在造模后48 h分別觀察大鼠炎癥指數(shù)。炎癥指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為正常（0分）；關(guān)節(jié)輕度腫脹、皮膚紅斑、骨性標(biāo)志可見（1分）；關(guān)節(jié)明顯紅腫，但局限于關(guān)節(jié)部位，骨性標(biāo)志消失（2分）；關(guān)節(jié)以外肢體腫脹（3分）。

炎癥指標(biāo)：ELISA法檢測關(guān)節(jié)軟骨組織白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和環(huán)氧合酶-2（COX-2）含量，于末次給藥1 h后處死大鼠，每組8只大鼠用1 mL生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔后收集關(guān)節(jié)液，取少量關(guān)節(jié)囊和滑膜組織制成勻漿，按ELISA試劑盒說明書測定各指標(biāo)含量。組織形態(tài)學(xué)觀察：處死大鼠，每組2只大鼠對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行固定、脫鈣、脫水、包埋、切片、HE染片后封片，觀察膝關(guān)節(jié)病理改變情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以表示，分析前行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)腫脹程度及炎癥評(píng)分

各組較假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)不同程度腫脹（P＜0.05），炎癥評(píng)分明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，吲哚美辛組和二丁顆粒劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及炎癥評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；二丁顆粒劑量組較吲哚美辛組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度及炎癥評(píng)分有一定增加，隨著二丁顆粒劑量的增加而均明顯降低。詳見表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度及炎癥評(píng)分比較（± s，n=10）

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度及炎癥評(píng)分比較（± s，n=10）

注：與假手術(shù)組相比，#P ＜0.05；與模型組相比，*P ＜0.05；與吲哚美辛組相比，△P＜0.05。下表同。

組別假手術(shù)組模型組吲哚美辛組二丁顆粒 低劑量組中劑量組高劑量組關(guān)節(jié)腫脹程度（mm）4.05 ± 5.3267.49 ± 8.05#11.40 ± 1.04#*45.45 ± 6.05#*△32.43 ± 2.02#*△17.52 ± 2.03#*炎癥評(píng)分（分）05.22 ±0.81#3.25 ±0.34#*4.57 ±0.38#*△3.69 ±0.99#*△3.31 ±0.44#*

2.2 關(guān)節(jié)軟組織中炎癥指標(biāo)

各組較假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中IL-1β，TNF-α，COX-2含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，吲哚美辛組和二丁顆粒劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中各指標(biāo)含量均明顯降低（P＜0.05）；二丁顆粒低、中劑量組較吲哚美辛組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中各指標(biāo)含量有一定增加，隨著二丁顆粒劑量的增加而明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中炎癥指標(biāo)比較（± s，ng/L，n=8）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟組織中炎癥指標(biāo)比較（± s，ng/L，n=8）

組別假手術(shù)組模型組吲哚美辛組二丁顆粒低劑量組中劑量組高劑量組IL-1β 19.24 ±2.9456.05 ±4.57#22.59 ±3.68#*45.24 ±5.93#*△35.00 ±4.61#*△24.59 ±4.38#*TNF-α 27.64 ± 2.1772.21 ± 4.81#39.54 ± 2.50#*60.57 ± 4.38#*△48.69 ± 2.99#*△41.73 ± 5.94#*COX-210.54 ± 1.5789.18 ± 8.1152.39 ± 4.35#*67.23 ± 4.18#*△59.30 ± 4.90#*△54.31 ± 7.61#*

2.3 病理組織形態(tài)學(xué)觀察

假手術(shù)組：關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，關(guān)節(jié)腔無滲出，滑膜細(xì)胞排列整齊；模型組：滑膜細(xì)胞增生，伴炎性細(xì)胞浸潤，小血管增生和成纖維細(xì)胞增多；吲哚美辛組：關(guān)節(jié)軟骨光滑，關(guān)節(jié)腔內(nèi)見少量滲出物，滑膜細(xì)胞排列較整齊，見少許炎性細(xì)胞浸潤；二丁顆粒組在炎癥、變性、壞死方面均較模型組輕，隨著二丁顆粒劑量的增加，癥狀有一定緩解。詳見圖1。

圖1 各組大鼠病理組織形態(tài)學(xué)觀察（HE，×400）

3 討論

痛風(fēng)屬中醫(yī)“痹癥”范疇，病因?yàn)闅庋\(yùn)行不暢、邪滯經(jīng)絡(luò)和濕熱內(nèi)蘊(yùn)，因此治療痛風(fēng)常以通絡(luò)止痛和清熱利濕為主［7］。二丁顆粒由板藍(lán)根、半邊蓮、紫花地丁、蒲公英組方，其中板藍(lán)根具有清熱解毒功效，半邊蓮、紫花地丁、蒲公英具有利濕、消腫、利尿散結(jié)功效［8］。本研究結(jié)果顯示，二丁顆粒具有消腫、抗炎功能，其效果與吲哚美辛相當(dāng)。

AGA以關(guān)節(jié)滑膜急性炎癥為特征，很可能有多種病因和各種病理途徑。炎癥過程被認(rèn)為是由巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生亞標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量的促炎細(xì)胞因子，這是炎性反應(yīng)的中心介質(zhì)［9］。在正常的局部炎性反應(yīng)中，促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生受到嚴(yán)格控制。但在AGA等情況下導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的濃度升高。研究表明，多種炎性因子參與了關(guān)節(jié)炎的發(fā)作，IL-1β是調(diào)節(jié)炎癥的始動(dòng)因素和炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，參與了急性和慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過程［10］。TNF-α是炎性后最早出現(xiàn)的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其過度表達(dá)時(shí)介導(dǎo)炎性因子趨化作用而加劇瀑布樣炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷。通過減少或拮抗TNF-α的產(chǎn)生可改善炎癥對(duì)大鼠造成的損傷［11］。選擇性COX-2抑制劑是為了應(yīng)對(duì)較少不良反應(yīng)的非甾體抗炎藥需求而開發(fā)，主要抑制COX-2酶。COX-2酶催化前列腺素的合成，參與炎性反應(yīng)。COX蛋白存在于 2種亞型（COX-1和COX-2），每種亞型在不同的細(xì)胞類型中都有不同的表達(dá)模式。COX-1已被建議用作為正常血小板、胃和腎功能提供前列腺素（PG）的生理水平，相反，COX-2被發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物炎癥部位和炎癥性疾病中高度誘導(dǎo)，因此，選擇性COX-2抑制劑的鎮(zhèn)痛和抗炎作用與非選擇性非甾體抗炎藥相似，但對(duì)胃腸道的不良作用大大降低［12］。本研究結(jié)果顯示，二丁顆粒可減低大鼠關(guān)節(jié)軟組織中IL-1β，TNF-α，COX-2含量，提示在減輕炎性反應(yīng)的同時(shí)，還能一定程度上減輕藥品不良反應(yīng)。

綜上所述，二丁顆粒對(duì)AGA具有良好的防治作用，其作用可能與抑制炎性因子IL-1β和TNF-α水平有關(guān)，同時(shí)還抑制COX-2。