2017—2018年江西地區耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子流行特征

曾 凌，鄧 瓊，劉 洋，張 杰，曾 婷，曹先偉

(1. 南昌大學第一附屬醫院醫院感染管理科，江西 南昌 330006； 2. 南昌大學第一附屬醫院檢驗科，江西 南昌 330006； 3. 南昌大學江西醫學院，江西 南昌 330006)

耐藥菌的出現與流行已成為全球一個不容忽視的嚴重公共衛生問題，越來越多的病原菌對常用抗菌藥物產生耐藥性，且耐藥水平不斷上升。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)臨床分離率高，耐藥譜廣，可造成區域性暴發流行，治療非常困難，導致患者住院時間明顯延長，醫藥費用大幅度增加，病死率增高[1-2]。殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)是壞死性細胞毒素，具有廣泛的溶胞作用，除可促進膿腫形成外，還可引起嚴重甚至致命性肺炎[3]。不同地區的 MRSA 流行株呈現規律性分布，主要流行克隆株有一定的地區差異，且可隨時間發生變遷，對當地分離菌株進行分子分型，了解菌株間的親緣關系，明確當地流行克隆，對臨床合理診治感染，以及減少和控制耐藥細菌的傳播有重要意義。本研究采用分子分型技術，研究江西省MRSA的分子流行病學特點，揭示MRSA的遺傳進化規律，并對PVL毒力基因進行檢測，比較不同克隆間毒力因子的差異，探討流行克隆可能的競爭優勢，并為后續的機制研究提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2017年1月—2018年12月江西省11個城市11所醫院臨床MRSA菌株。所有標本均為無菌體液(血、尿、關節液、腦脊液、封閉的腹腔積液等)、高質量呼吸道標本(深部痰、支氣管灌洗液等)，以及傷口分泌物等。為更好的體現MRSA感染的流行病學特征，僅納入同一患者首次分離的菌株。所有菌株除采取常規手工鑒定以及全自動細菌鑒定系統VITEK 2 Compact進行鑒定外,同時經mecA+femB 雙重 PCR 法雙陽性者確認為 MRSA。

1.2 主要儀器與試劑 PCR儀(Bio-Rad)，VITEK濁度儀(BioMerieux)，脈沖場凝膠電泳儀(Bio-Rad)，EDTA(北京鼎國)，蛋白酶K(上海生工)，溶葡萄球菌酶(上海生工)，Sma I 限制性內切酶(Takara)，瓊脂糖(Biowest)，Ex Taq DNA 聚合酶(Takara)。

1.3 引物設計與合成 spa分型、SCCmec分型、多位點序列分型(MLST)及PVL基因所使用的引物參照文獻[4-5]設計，引物合成及擴增產物測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.4 方法

1.4.1 藥敏試驗 鑒定儀為法國VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏儀，釆用微量稀釋法做體外藥物敏感性試驗，參照美國臨床實驗室標準化協會(M100-S27)規定的標準和EUCAST標準判斷藥物的敏感性。金黃色葡萄球菌ATCC 25923作為質控菌株。

1.4.2 spa分型 spa分型主要是基于spa基因X區重復序列的多態性,參照文獻[6]，采用PCR方法擴增spa目標序列并測序，截取重復序列區域，登錄官方網站(http://www.ridom.de/spaserver/)，得到該菌株的 spa 型別。

1.4.3 SCCmec分型 采用多重PCR方法[7]擴增SCCmec目標序列，在紫外凝膠成像儀下觀察是否出現目的條帶，依據條帶位置確定分型。

1.4.4 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型和多位點序列分型(MLST) 綜合應用PFGE和MLST對菌株進行同源性分析。 用SmaI(Bio-Rad Laboratories，CA，USA)消化整個染色體DNA，并在CHEF Mapper XA System中分離限制性片段。通過Dice相似系數和未加權配對組匹配算法(UPGMA)進行聚類分析，MLST是以7個管家基因(arcc、gmk、aroe、glp、pta、tpi、ygil)為基礎進行型別分析。參照文獻[8]，采用PCR方法擴增MLST的7對目標序列并測序，確認測序結果質量后將得到的結果序列提交至官方網站(http://www.mlst.net/)，確定每一株菌的等位基因譜，并得到該菌株的MLST型別。

1.5 數據分析 應用WHONET 5.6對數據進行分析。

2 結果

2.1 MRSA來源與分布 2017年1月—2018年12月江西省11所醫院共收集臨床分離MRSA 250株，經mecA+femB雙重PCR擴增和綜合藥敏結果確認后，納入本研究的MRSA 237株，其中，南昌32株，九江25株，景德鎮19株，上饒40株，鷹潭27株，撫州21株，新余6株，宜春10株，萍鄉17株，吉安20株，贛州20株。標本類型中，主要為分泌物，占31.22%(74株)，痰占29.11%(69株)，血占16.46%(39株)。見圖1。

圖1 江西省MRSA地區及標本來源分布

2.2 spa分型結果 對237株MRSA進行spa分型，共分為40個型別，發現新的spa基因型3株。其中主要型別為t437(74株，占31.22%)、t030(32株，占13.50%)、t114(20株，占8.44%)、t172(15株，占6.33%)、t441(14株，占5.91%)、t062(11株，占4.64%)。不同地區MRSA分離株的spa型別存在差異，除南昌地區以t030為主，其余地區均以t437為主，其他spa型別散在分布于各地區。

2.3 SCCmec基因分型結果 對237株MRSA分離株進行SCCmec基因分型，結果表明 SCCmecIVa為優勢型別共158株，占66.67%；SCCmecⅢ共35株，占14.77%；SCCmecⅡ共32株，占13.50%；SCCmecⅴ共8株，占3.38%；未分型菌株4株。從各地區分布來看，南昌地區以SCCmecⅢ為主要型別，占59.38%(19/32)；其余各地區均以SCCmecIVa為主要優勢型別。

2.4 PFGE分型和MLST結果 對237株MRSA進行PFGE分型，經聚類分析，結果為A～V 21個聚類組，從每一聚類組中抽取代表菌株進行MLST分析，優勢型別為ST239、ST59、ST1和ST338克隆，分別占44.30%(105株)、32.07%(76株)、4.64%(11株)和2.53%(6株)，其他克隆型別散在分布，同時發現3株新的ST克隆型別。

通過eBURST軟件聚類分析，21種不同型別的克隆分為9個克隆群(clonal complex,CC)。ST239屬于CC239克隆群，是最優勢的克隆群，占44.30%(105株)；ST59屬于CC59克隆群，同時還包括ST1778、ST2207、ST338、ST545、ST925、ST3191克隆型，占42.19%(100株)；ST1屬于CC1克隆群，同時還包括ST726和ST2125，占6.33%(15株)；ST4和ST45型同屬于CC4克隆型，占1.69%(4株)；其余ST7、ST5、ST409、ST70、ST1232分別屬于不同克隆群。見圖2。

圖2 21種ST型別的聚類分析(eBURST)

2.5 PVL毒力因子檢測結果 237株MRSA中，檢出PVL 32株,檢出率為13.50%。地區分布顯示，鷹潭地區PVL檢出率最高，為29.63%，其次景德鎮地區為26.32%，吉安地區為25.00%。分子分型顯示，PVL陽性菌株中spa型別主要為t437型，占59.38%(19/32)，且19株t437型菌株SCCmec分型均為IVa，其中16株為ST59，江西地區PVL陽性菌株的主要型別為ST59-MRSA-IVa-t437型，見表1、2。

2.6 MRSA 分子特征 各種分型方法綜合分析顯示，ST59-MRSA-IVa-t437為江西地區的主要優勢流行克隆型，且各地區之間存在一定程度的克隆播散。ST239-MRSA-Ⅲ-t030為次要優勢流行克隆型，主要在南昌地區多見，其他地區散發，詳見表3。

3 討論

研究[9-10]表明，MRSA醫院感染主要是由少數流行菌株引起，這些菌株一旦在醫院定植，即可造成醫院或地區，甚至不同國家之間的暴發流行?？刂屏餍械闹匾呗栽谟诿鞔_流行環節，切斷傳播途徑，終止耐藥菌株在人群中的傳播。因而，掌握分子特征對于鑒別菌株間的親緣性，有效控制感染意義重大。為鑒別流行菌株，追蹤傳染源，國內外廣泛采用的方法是對臨床分離菌株進行分型研究，以確定菌株之間的同源性，從而為制定感染控制策略提供依據。

表1 各地區PVL毒力因子陽性情況

表2 32株PVL毒力基因陽性株各分型分布(株)

spa分型以spa基因的高變區X區為目標基因，具有分辨率高、分型能力強、檢測速度快、結果命名標準化的優點，結果可相互比較，但對于極少數菌株分型可能有誤差。SCCmec分型針對可移動元件分型，結果有國際標準，不同實驗室的結果可進行比較。SCCmec分型的主要方法是多重PCR法或實時熒光定量PCR法，其中多重PCR因為無需特殊設備和相對較低的成本，應用更廣，且對常見的SCCmec分型有較好的效果[10]。PFGE分型可較準確地分辨某地區某時期內流行菌株間同源性關系及各醫院間相互傳播情況，但不適用于長時間的全球流行病學監測。而MLST的應用很好地解決了此問題，其以7個管家基因(arcc、aroe、glp、gmk、pta、tpi、yqil)為基礎，結果定義國際化，可相互比較，適用于宏觀進化的研究，但此方法價格昂貴，分型能力稍低。此外，對特殊菌株可采取全基因組測序分型，進行全基因組比較，但此方法價格昂貴，技術要求高，分析比較復雜[11]。

表3 237株MRSA主要分子分型結果(株)

注：除CC239、CC59、CC1、CC4幾個主要的克隆群外，其余ST7、ST5、ST409、ST70、ST1232分別屬于不同克隆群。僅列出MRSA 的主要分子分型結果，一些散在的分型未列出

目前，全球MRSA主要流行克隆型包括ST239-Ⅲ型(巴西/匈牙利克隆)、ST247-IA(伊伯利亞克隆)、ST45-IV(柏林克隆)等[12-14]，亞洲地區MRSA流行趨勢與其他地區不同，不同國家和地區之間差異也很大。如ST45-MRSA-IV克隆，也稱為柏林流行株，常引起血流感染或呼吸道疾病病例暴發，而在中國大陸卻少見報道。ST59-MRSA-IVa-t437為江西地區主要優勢流行克隆型，且各地區之間存在一定程度的克隆播散。ST239-MRSA-Ⅲ-t030為次要優勢流行克隆型，主要在南昌地區多見，其他地區散發，該結果與熊祝嘉等[9]對全國6個地區7所醫院114株樣本的分型結果基本相符。spa是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子，能幫助細菌逃避宿主的免疫反應。2009發現spa-t030克隆成為優勢克隆型別后，相關研究進一步發現ST239-MRSA-III-t030具特定耐藥譜，且其生存能力更強[15]。但仍需要警惕ST59的克隆播散，ST59-t437克隆型別的MRSA比ST239-t030-MRSA更易導致基因結構的變化，降低藥物敏感性[16]。同時ST59菌株在美國、新加坡、中國臺灣地區及香港地區的CA-MRSA中廣泛傳播[17]。ST59-MRSA在中國的南方兒科患者中也普遍存在[18]，江西地區的流行克隆株，可能是中國香港、臺灣地區傳播至中國內陸地區所致[19]。而ST59一直被認為是中國地區CA-MRSA最常見克隆，加拿大的一項研究[20]顯示，醫院感染從2007—2011年短短5年CA-MRSA的比例翻了一倍。深圳市9所醫院研究[7]顯示，28.9%的HA-MRSA菌株是CC59-MRSA-IV/V-t437克隆，是典型的CA-MRSA的特征。亞洲各國面臨同樣處境，研究[14,20]顯示，ST59-MRSA-IV-t437克隆在中國臺灣地區以及韓國的醫院均有報道。

不同國家、地區MRSA SCCmec優勢型別也存在明顯差異。亞洲地區，日本和韓國以SCCmec Ⅱ型為優勢型別，我國香港和臺灣地區均以SCCmec Ⅲ型為優勢型別[21]。本研究結果表明，江西地區以SCCmecIVa為優勢型別，占66.67%；SCCmecⅢ和SCCmecⅡ分別占15.19%、13.50%；從各地區分布來看，除南昌地區以SCCmec Ⅲ為主要型別外(占59.38%)，其余各地區都是以SCCmecIVa為主要優勢型別。SCCmec Ⅲ型以HA-MRSA為主，SCCmecIVa以CA-MRSA為主，考慮南昌地區醫院為省級醫院，收治的患者多為各地區的重癥患者，更易發生醫院感染，而下級醫院收治患者病情較輕，感染更多來自社區。CA-MRSA菌株中由于SCCmec元件相對較小，其負載的耐藥基因較少，更有利于傳播，造成大范圍的流行。另外本研究未見 SCCmec I 型菌株，近年來也尚未見到相關研究報道，推測可能I型菌株為最早的流行菌株，流行時間長，已被Ⅱ、Ⅲ型菌株取代[22]。

本研究237株MRSA PVL陽性率為13.50%。研究[23]顯示，攜帶PVL毒素的致病性金黃色葡萄球菌與皮膚及軟組織感染、壞死性肺炎、壞死性筋膜炎等嚴重壞死性疾病密切相關，且致死率較高。2000年以前，未發現HA-MRSA中攜帶PVL，PVL曾被認為是CA-MRSA的特有生物學標記[24]。但近年研究發現，HA-MRSA中也可檢出PVL基因，而CA-MRSA菌株也可不攜帶PVL基因[24-25]。本研究中PVL陽性株無明顯CA-MRSA或HA-MRSA偏向，表明PVL并非是CA-MRSA的特有生物學標記，在HA-MRSA中PVL檢出越來越常見，有產生高耐藥、高毒力菌株的趨勢，值得關注。從城市分布來看，鷹潭地區PVL陽性率最高，景德鎮地區檢出率次之，吉安地區檢出率第三，呈現由東部向四周降低的趨勢。因此，要加強對東部地區MRSA PVL陽性菌株的研究。

由此可見，不同型別的MRSA耐藥情況和耐藥機制并不完全一致，更加突出了對MRSA進行分子學分型的重要性，臨床醫生在選擇抗菌藥物時應注意不同型別菌株的耐藥情況，在耐藥率逐漸升高的情況下，有效控制患者病情顯得尤為重要。本研究中，雖然選取了11個地級市11所三甲醫院，盡量保證菌株的代表性與可比性，MRSA克隆分布的不均一性仍然存在一些不可控性，一方面可能與獨特的地理位置密切相關；另一方面，不同城市的經濟發展水平與醫療資源的配置也不同，而且流動人口也可能導致MRSA的克隆分布不均一。