鏈霉菌CPCC 200510產生的大黃酚及其類似物的鑒定

黎林麗，李婷，江冰婭，李書芬，劉紅宇，余利巖，何紅偉，李玉環，武臨專

鏈霉菌CPCC 200510產生的大黃酚及其類似物的鑒定

黎林麗，李婷，江冰婭，李書芬，劉紅宇，余利巖，何紅偉，李玉環，武臨專

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所衛計委抗生素生物工程重點實驗室/中國醫學科學院藥物合成生物學重點實驗室

鏈霉菌具有豐富次級代謝產物合成能力，對鏈霉菌CPCC 200510 產生的色素類次級代謝產物進行研究。

對該菌株的次級代謝產物進行乙酸乙酯提取、ODS色譜柱分離、半制備HPLC 分離純化、NMR 結構解析和生物活性檢測。

得到6 個黃色化合物，分別為1,8-二羥基-3-甲基蒽醌（大黃酚，1）、2-乙酰-1,8-二羥基-3-甲基蒽醌（2）、2-乙酰-1,8-二羥基-3-羧甲基蒽醌（3）、1,2,8-三羥基-3-甲基蒽醌（4）、1-(7-乙酰-8-羥基苯并[]色烯-2-基)-2-丙酮（5）和1-(8-羥基-2-甲基苯并[]色烯-7-基)乙酮（6），為一組生物合成相關的芳香聚酮類化合物。其中，1 ~ 3為鏈霉菌CPCC 200510 產生的主要組分。生物活性測定表明，1 ~ 3具有抗腫瘤細胞或抗病毒活性。

鏈霉菌CPCC 200510 有望作為大黃酚類化合物的微生物產生菌。

大黃酚； 鏈霉菌CPCC 200510； 芳香聚酮

芳香聚酮類化合物是一類重要的天然產物，其中由鏈霉菌產生的四環素和阿霉素等是臨床上重要的抗菌和抗腫瘤藥物。

鏈霉菌（）CPCC 200510 具有產生豐富的色素類化合物特性。對該菌株產生的脂溶性色素類化合物進行了分離純化和鑒定，確定為大黃酚（chrysophanol）及其類似物。

1 材料和方法

1.1 材料

酵母提取物和麥芽提取物均為英國 Oxoid 公司產品；高氏 1 號培養基為廣州環凱生物科技有限公司產品；乙腈為美國 Fisher 公司產品；乙酸乙酯等有機試劑為國產分析純試劑；制備型硅膠板為煙臺江友硅膠開發有限公司產品；ODS 填料和HPLC 半制備色譜柱 YMC-Pack ODS-A（250 mm × 10 mm，S-5 μm，12 nm）為日本 YMC 公司產品；HPLC 分析色譜柱 Diamonsil C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）為北京迪馬科技有限公司產品；EYELAN-1100 型旋轉蒸發儀為日本東京理化公司產品；1260 型高效液相色譜儀為美國安捷倫公司產品；LC-20A 型高效液相色譜儀為日本島津公司產品；LTQ XL 質譜分析儀為美國 Thermo Fisher Scientific 公司產品；AVIII HD核磁共振儀（600 MHz，TMS 為內標）為德國 Bruker 公司產品。大黃酚對照品為合肥博美生物科技有限責任公司產品。

鏈霉菌 CPCC 200510 由中國藥學微生物菌種保藏中心提供；人結腸癌細胞系 HCT116 和單純皰疹病毒 1 型（HSV-1）由本所腫瘤室和藥理室分別保藏并提供。

培養基：ISP2（葡萄糖 4.0 g/L、酵母提取物4.0 g/L、麥芽提取物 10.0 g/L、瓊脂粉 15.0 g/L，pH 自然）；高氏 1 號培養基（可溶性淀粉 20 g/L、氯化鈉 0.5 g/L、硫酸亞鐵 0.01 g/L、硝酸鉀 1.0 g/L、磷酸氫二鉀 0.5 g/L、硫酸鎂 0.5 g/L、瓊脂粉 15 g/L，pH 7.3）。

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌CPCC 200510 培養與發酵 將保藏的孢子懸液接種于 ISP2 平板，28 ℃培養 7 ~ 10 d，出現灰色的成熟孢子層，用適量無菌水洗滌并收集，獲得新鮮孢子懸液，涂布于高氏 1 號培養基平板，28 ℃發酵培養 10 d，收集發酵培養物，用于分離純化目標次級代謝產物。

1.2.2 鏈霉菌CPCC 200510 產生的脂溶性色素類化合物化學分析 發酵培養物用乙酸乙酯等體積提取 3 次；收集黃色的乙酸乙酯提取液，減壓濃縮得粗提物。對粗提物進行硅膠板 TLC 分析（展開劑：二氯甲烷:甲醇 = 9:1）和 HPLC 分析（含 0.1% 冰醋酸的 15% ~ 100% 甲醇-水系統梯度洗脫，60 min，流速 1.0 ml/min；檢測波長 254 和 430 nm）。

1.2.3 脂溶性色素類化合物的分離純化 30 L 發酵培養物經乙酸乙酯提取并旋干后得粗提物 12 g，上 ODS 反相柱（長度 460 mm，內徑 33 mm），甲醇-水（含 0.1% 冰醋酸）線性梯度洗脫（流速20 ml/min）：15% ~ 78% 甲醇洗脫 110 min，78% ~ 100% 甲醇洗脫 90 min，100% 甲醇洗脫 60 min。獲得 6 個洗脫合并組分（I ~ VI）。對 6 個組分濃縮后分別進行 HPLC 半制備純化（等度洗脫，流動相均含 0.1% 冰乙酸，流速 1.5 ~ 2.0 ml/min），得到 6 個黃色化合物純品（1~6）；所使用的流動相分別為：1和2，85% 乙腈-水；3，70% 甲醇-水；4，75% 乙腈-水；5，60% 乙腈-水；6，90% 乙腈-水。1~6純品用于 NMR 測定，1~3純品用于生物活性測定。

1.2.4 抗腫瘤細胞活性測定 對主要組分1~3進行抗人結腸癌細胞系HCT116 活性測定。化合物1、2和3用 DMSO 溶解后，用培養液稀釋，細胞加藥培養 48 h 后，取出培養板，于每孔加入 50 μl 預冷的 50% 三氯醋酸，靜置 5 min 后移入4 ℃冰箱中靜置 1 h，取出用去離子水洗 5 遍，空氣中干燥，待完全干燥后每孔加入 1% 的乙酸配制的 0.4% 的 SRB 100 μl，染色 20 min 后倒掉染液，用 1% 乙酸洗 5 次，去除未結合的染料。空氣中干燥后用 pH 10.5 的 10 mmol/L 的非緩沖 Tris 堿液 150 μl 溶解，在平板振蕩器上振蕩 5 min，在 BioRad 酶標儀上測定各孔在 490 nm 的光吸收，測定對腫瘤細胞系 HCT116 的 IC50值。

1.2.5 抗 HSV-1 活性測定 對主要組分1~2進行抗 HSV-1 活性測定。化合物1~2用 DMSO 溶解后用培養液稀釋，以無環鳥苷（ACV）作陽性對照藥。Vero 細胞種 96 孔板，24 h 后感染HSV-1 10-4，吸附 2 h，棄病毒液，加入含稀釋化合物及陽性對照藥的維持液，同時設細胞對照孔和病毒對照孔，待病毒對照組病變程度（CPE）達 4+ 時觀察各組細胞病變程度，用 Reed-Muench 法分別計算化合物1~2對 HSV-1 的半數抑制濃度（IC50）。

2 結果

2.1 鏈霉菌CPCC 200510 產生脂溶性黃色化合物

鏈霉菌CPCC 200510 的乙酸乙酯提取液呈黃色。硅膠板 TLC 分析出現 2 個黃色條帶；HPLC 分析出現 3 個主要洗脫峰，其紫外-可見吸收光譜基本相同（圖 1），提示是一組結構類似物。經 LC-MS 分析，確定 3 個主要洗脫峰中的化合物分子量分別為 254、296 和 340。

圖 1 鏈霉菌 CPCC 200510 乙酸乙酯提取物的 TLC（A）和 HPLC（B）分析結果

Figure 1 TLC (A) and HPLC (B) analysis of ethyl acetate extract ofsp. CPCC 200510

2.2 從鏈霉菌CPCC 200510 中分離得到 6 個黃色化合物

通過乙酸乙酯提取、ODS 色譜柱和 HPLC 半制備分離純化，從鏈霉菌CPCC 200510 發酵培養物中分離得到編號1~6的 6 個黃色化合物，分別來自 ODS 柱分離的合并組分 II、IV、V、VI、I 和 III。其中，1~3為鏈霉菌CPCC 200510 產生的主要組分，4~6為次要組分。采用高氏 1 號培養基，主要組分1、2和3的產量分別約為 22、18 和76 mg/L。

2.3 黃色化合物屬于大黃酚及其類似物

化合物1~6經 NMR 解析，確定其均屬于文獻報道過的芳香聚酮類化合物。

化合物1為黃色粉末，分子量 254，NMR（600 MHz，CDCl3）解析并結合SciFinder 數據庫分析，確定其為 1,8-二羥基-3-甲基蒽醌（圖 2），分子式 C15H10O4，即大黃酚。核磁數據如下：1H-NMR，（ppm），2.47（s，3H，CH3-3），7.10（s，2H，H-2），7.29（d，1H，= 1.2 Hz，H-7），7.67（t，2H，= 8.4 Hz，H-6），7.82（dd，1H，= 1.2，6.6 Hz，H-5），12.02（s，1H，1-OH），12.13（s，1H，8-OH）；13C-NMR，（ppm），193.4（C-9），183.1（C-10），117.0（C-8a），163.5（C-8），150.5（C-3），138.0（C-4a），134.7（C-10a），134.3（C-6），125.6（C-5），125.4（C-7），122.4（C-4），121.0（C-2），163.8（C-1），114.7（C-9a），23.6（CH3-3）。

化合物2為黃色粉末，分子量 296，NMR（600 MHz，CDCl3）解析并結合SciFinder 數據庫分析，確定其為 2-乙酰-1,8-二羥基-3-甲基蒽醌（圖 2），分子式C17H12O5。核磁數據如下：1H-NMR，（ppm），2.41（s，3H，H-2'），2.62（s，3H，CH3-3），7.31（d，1H，= 1.2 Hz，H-7），7.70（t，1H，= 8.4 Hz，H-6），7.84（d，1H，= 0.6 Hz，H-5），11.95（s，1H，8-OH），12.36（s，1H，1-OH）；13C-NMR，（ppm），31.9（C-2'），202.3（C-1'），137.4（C-2），162.6（C-1），114.1（C-9a），192.3（C-9），115.7（C-8a），159.4（C-8），124.9（C-7），133.1（C-10a），122.2（C-5），133.1（C-6），181.4（C-10），136.2（C-4a），120.2（C-4），145.5（C-3），20.2（CH3-3）。

化合物3為黃色粉末，分子量 340，NMR（600 MHz，CDCl3）解析并結合SciFinder 數據庫分析，確定其為 2-乙酰-1,8-二羥基-3-羧甲基蒽醌（圖 2），分子式C18H12O7。核磁數據如下：1H-NMR，（ppm），2.64（s，3H，H-2'），3.79（s，1H，H-4），3.81（s，2H，H-1''），7.31（d，=6.0 Hz，1H，H-7），7.71（dd，= 6.0，12.0 Hz，1H，H-6），7.80（d，= 6.0 Hz，1H，H-5），11.91（s，1OH，H-1），12.39（s，1OH，H-2''）；13C-NMR，δ（ppm），31.28（C-2'），203.61（C-1'），135.88（C-2），159.54（C-1），115.18（C-9a），192.53（C-9），115.68（C-8a），163.34（C-8），124.83（C-7），137.51（C-6），120.09（C-5），133.5（C-10a），181.22（C-10），133.2（C-4a），122.26（C-4），142.01（C-3），38.4（C-1''），171.1（C-2''）。

化合物4為橘黃色粉末，分子量 270，NMR（600 MHz，CDCl3）解析并結合 SciFinder 數據庫分析，確定其為 1,2,8-三羥基-3-甲基蒽醌（圖 2），分子式C15H10O5，即 2-羥基大黃酚。核磁數據如下：1H-NMR，δ（ppm），2.38（s，3H，3-CH3），7.16（s，1H，H-4），7.29（dd，1H，= 1.2，8.4 Hz，H-7），7.68（t，1H，= 7.8 Hz，H-6），7.88（dd，1H，= 1.2，7.8 Hz，1.5，H-5），12.28（s，1H，2-OH），12.32（s，1H，1-OH），13.48（s，1H，8-OH）；13C-NMR，（ppm），157.7（C-2），162.5（C-1），111.6（C-9a），190.4（C-9），116.2（C-8a），157.8（C-8），110.7（C-7），136.8（C-6），119.3（C-5），141.8（C-10a），186.5（C-10），129.0（C-4a），124.5（C-4），133.6（C-3），16.6（3-CH3）。

圖 2 化合物1 ~ 6化學結構

Figure 2 Chemical structure of 1 - 6

化合物5為淡黃色粉末，分子量為 282，NMR（600 MHz，DMSO-6）解析并結合 SciFinder 數據庫分析，確定其與文獻報道的代號為 RM18 化合物相同[系統命名為1-(7-乙酰-8-羥基苯并[]色烯-2-基)-2-丙酮，分子式 C17H14O4，結構見圖 2]。核磁數據如下：1H-NMR，（ppm），1.2（s，1OH，H-15），2.16（s，3H，H-1），2.45（s，3H，H-17），3.55（s，2H，H-3），6.11（s，1H，H-5），6.36（s，1H，H-14），6.67（d，= 6.6 Hz，1H，H-7），7.23（t，= 7.2 Hz，1H，H-8），7.57（d，= 8.4 Hz，1H，H-9）；13C-NMR，（ppm），29.6（C-1），204.0（C-2），47.2（C-3），149.7（C-4），106.8（C-5），129.2（C-6），114.4（C-7），130.1（C-8），120.7（C-9），133.0（C-10），116.7（C-11），155.7（C-12），98.7（C-13），159.5（C-14），113.8（C-15），201.8（C-16），32.6（C-17）。

化合物6為淡黃色粉末，分子量240，NMR（600 MHz，DMSO-6）解析并結合 SciFinder 數據庫分析，確定其與文獻報道的代號為 RM18b 化合物相同[系統命名為1-(8-羥基-2-甲基苯并[]色烯-7-基)乙酮，分子式 C15H12O3，結構見圖 2]。核磁數據如下：1H-NMR，（ppm），2.14（s，3H，H-1），2.75（s，3H，H-15），5.97（s，1H，H-3），6.39（s，1H，H-12），6.76（d，= 7.2 Hz，1H，H-5），7.40（dd，= 7.2，7.2 Hz，1H，H-6），7.63（d，= 8.4 Hz，1H，H-7），14.49（s，1OH，H-12）；13C-NMR，（ppm），18.8（C-1），156.3（C-2），104.0（C-3），130.0（C-4），113.5（C-5），129.2（C-6），120.1（C-7），132.8（C-8），116.6（C-9），155.7（C-10），98.7（C-11），159.5（C-12），113.8（C-13），201.8（C-14），32.6（C-15）。

2.4 化合物 1 ~ 3 的抗腫瘤細胞和抗病毒活性

化合物1、2和3對人結腸癌細胞 HCT116 的 IC50值分別為 57.59、16.46和 43.39 μmol/L，表明它們對腫瘤細胞具有較弱的體外抑制活性。

化合物1對 HSV-1 的 IC50和 TC50分別為大于 11.11 和 48.07 μg/ml，化合物2對 HSV-1 的 IC50和 TC50分別為 2.81 ~ 7.70 和 23.11 μg/ml；陽性對照藥物 ACV 對 HSV-1 的 IC50和 TC50分別為 0.34 ~ 0.41 和大于 100 μg/ml。因此，化合物1和2具有微弱的抗 HSV-1 病毒活性。

3 討論

化合物1~4屬于蒽醌類。蒽醌類化合物是多種植物的次生代謝產物，在掌葉大黃（）中含量比較高，其中的主要成分為大黃酚（1）和大黃素（emodin，1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌）。此外，Li 和 McLaughlin[1]從藥用植物鐵仔（）中發現4。

微生物也產生蒽醌類次級代謝產物。例如，Fotso 等[2]從一株鏈霉菌中發現了1；Abdelfattah[3]從另外一株鏈霉菌中發現了2；McDaniel 等[4-5]通過基因工程技術將富倫菌素（frenolicin）與放線紫紅素（actinorhodin）的生物合成基因在天藍色鏈霉菌（）中進行組合，產生了多個芳香聚酮類化合物，包括 SEK26（3），以及 RM18（5）和 RM18b（6）。

化合物1~6可能是在鏈霉菌 CPCC 200510 中相同的芳香聚酮合酶催化下，將 8 個或 9 個二碳單位（乙酰 CoA）聚合生成線性的八酮體或九酮體，再經一系列不同的修飾反應（還原、氧化、脫水和脫羧等），生成主要組分1~3和次要組分4~6（圖 3）。其中，5~6是聚酮鏈芳香環化過程中的支路產物（shunt product）[6]，4是1的羥基化衍生物，2是3的脫羧產物[7]。化合物3在乙腈等溶劑中發生緩慢的自發脫羧反應生成2；化合物1和4~6在其生物合成過程中也發生過脫羧反應，但沒有檢測到未脫羧的前體物。

蒽醌類主要有致瀉、抗菌和抗腫瘤等作用或活性。對分離得到的主要組分進行初步的生物活性測定表明：1~3具有中等的抗腫瘤細胞活性，1~2具有微弱的抗病毒活性。此外，還檢測到1~2具有抗革蘭氏陽性菌活性。

文獻[8]報道一株諾卡氏菌（）產生大黃酚，產量約 30 mg/L。鏈霉菌CPCC 200510 與該菌株的大黃酚產量基本相當。預期通過發酵條件優化可以進一步提高鏈霉菌CPCC 200510 的大黃酚及類似物的產量，使該菌株有望成為大黃酚及其類似物的微生物生產菌株。

圖 3 推測的1 ~ 6生物合成相關性

Figure 3 The speculated biosynthetic relationship of 1 ~ 6

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Identification of chrysophenol and its congeners fromsp. CPCC 200510

LI Lin-li, LI Ting, JIANG Bing-ya, LI Shu-fen, LIU Hong-yu, YU Li-yan, HE Hong-wei, LI Yu-huan, WU Lin-zhuan

Author Affiliation: NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, CAMS Key Laboratory of Synthetic Biology for Drug Innovation, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To identify secondary metabolite(s) produced bysp.CPCC 200510.

TLC and LC-MS were used to analyze the EtOAc extract of fermentation culture ofsp.CPCC 200510.EtOAc extraction, ODS column chromatography and preparative HPLC were employed to purify secondary metabolites fromsp.CPCC 200510. Chemical structures of the purified metabolites were assayed by NMR.

Six yellow compounds (1 - 6) were purified fromsp.CPCC 200510, with 1 - 3 as main components. The structures of 1 - 6 were determined as 1,8-dihydroxy-3-methyl-9,10-anthraquinone (1, chrysophenol), 2-acetyl-1,8-dihydroxy-3- methyl-9,10-anthraquinone (2), 2-acetyl-1,8-dihydroxy-3-carboxymethyl-9,10-anthraquinone (3), 1,2,8-trihydroxy-3-methyl-9,10- anthraquinone (4), 1-(7-acetyl-8-hydroxybenzo[]chromen-2-yl) propan-2-one (5) and 1-(8-hydroxy-2-methylbenzo[]chromen- 7-yl)ethanone (6), respectively. 1 - 3 showed moderate cytotoxicity against cancer cell line HCT116, and 1 - 2 displayed some activity against HSV-1. 1 - 6 are a group of biosynthetically related aromatic polyketides.

sp.CPCC 200510 is a promising microbial producer for chrysophenol or its congeners.

CHRYSOPHANOL;sp.CPCC 200510; Aromatic polyketides

WU Lin-zhuan, Email: wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.002

中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（CAMS-I2M- 3-012）；國家微生物資源基礎平臺（NIMR-2018-3）；國家自然科學基金（81573328）

武臨專，Email：wulinzhuan@imb.pumc.edu.cn

2019-05-08