基于流式細胞術的淋巴細胞亞群分類試驗條件比較

姜華，文海若，劉麗，顏玉靜，霍艷

基于流式細胞術的淋巴細胞亞群分類試驗條件比較

姜華*，文海若*，劉麗，顏玉靜，霍艷

100176 北京，中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監測中心藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室

比較不同抗體稀釋度和多聚甲醛濃度對流式細胞術測定淋巴細胞亞群分類結果的影響。

取猴抗凝全血經濃度為 1% 或 4% 的多聚甲醛固定后連續4 d 上機測定淋巴細胞熒光強度及 CD3+、CD4+、CD8+、CD20+百分率及 CD4+/CD8+比值。取猴抗凝全血 50 μl 分別與1、3、5 和 10 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體混合后連續 7 d 上機測定 CD4+和 CD8+熒光強度及 CD4+與 CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值。

經 1% 多聚甲醛固定至第 4 天檢測雄性動物 CD4+、CD8+、CD3-CD20+百分率和雌性動物 CD8+百分率與樣本制備當天相比存在顯著性差異（< 0.05，< 0.01），且存在時間依賴性。樣本保存至第 4 天時以 1% 多聚甲醛保存的樣本 CD4+、CD8+、CD3-CD20+百分率與 4% 多聚甲醛保存的樣本相比亦存在顯著性降低（< 0.05，< 0.01，< 0.001）。50 μl 抗凝全血中添加 1 μl 抗體時，自制備后第 4 天起CD4+平均熒光強度即顯著降低（< 0.01）。所有樣本至第 4 天起，CD4+及 CD8+平均熒光強度顯著性衰減（< 0.01）。

不同多聚甲醛使用濃度、抗體用量及保存時間均對樣本的狀態和試驗結果產生一定影響。如流式樣本當天無法測定，樣本可于4% 濃度的多聚甲醛中穩定保存至制備后第 4 天檢測；在 50 μl 全血中應添加至少 3 μl 抗體用于檢測，以保證流式細胞儀對淋巴細胞表型識別的靈敏度，檢測應于樣本制備后 3 天內完成。

流式細胞術； 抗體； 淋巴細胞亞群分類； 食蟹猴； 多聚甲醛

生物制品的潛在免疫毒性風險不可小覷[1]。CD28 超級激活劑 TGN1412 在臨床試驗中曾出現多臟器衰竭甚至昏迷的嚴重毒性反應[2]，受到社會廣泛關注，故在非臨床安全性評價階段有必要完善免疫毒性評價。使用流式細胞術（flow cytometry，FCM）對淋巴細胞亞群，如 CD3+、CD4+、CD8+等指標進行檢測，已成為生物制品安全性研究及評價中常規而重要的免疫毒性評價指標。淋巴細胞根據表面標志的不同分為 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、NK 細胞等，而 T 淋巴細胞分為輔助和殺傷細胞亞群，在 HIV 或其他免疫性疾病的診斷、預后等都起著很重要的作用[3]。FCM 被認為是血液中淋巴細胞免疫表型分析的標準方法，其原理為表達不同表面抗原的淋巴細胞結合不同熒光抗體，被特定的激光激發后，收集不同的熒光和散射光信號對細胞進行分析計數[4]。與免疫組化檢測法相比，FCM 靈敏度高且更客觀，更適宜對某一指標作定量檢測[5]。然而，流式樣本制備過程中多種因素可能對其結果產生干擾。如抗體組合的選擇[6]、抗體稀釋比例、固定液多聚甲醛的濃度[7]、血樣放置時間、保存溫度、抗凝劑的選擇[8]等。保證試驗條件的一致性及可靠性，是對受試物免疫毒性作出客觀評價的基石[9]，也是確保免疫毒性的評價符合藥物非臨床研究質量管理規范（good laboratory practice，GLP）的前提。

食蟹猴為生物技術藥物臨床前安全性評價常用動物模型，本研究采集食蟹猴血樣比較不同濃度多聚甲醛（1% 和 4%）以及不同抗體與全血稀釋濃度（1:50、3:50、5:50 和 10:50）對外周血淋巴細胞亞群分類結果的影響，以確立多聚甲醛使用濃度和全血稀釋度的最優條件，為淋巴細胞亞群分類流式檢測條件的優化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 普通級食蟹猴共 34 只，雌雄各半，購入時 3 ~ 4 歲，購自廣西雄森靈長類實驗動物養殖開發有限公司。動物生產許可證號 SCXK（桂）2011-0002 和 SCXK（桂）2016-0001。飼養于普通級動物房不銹鋼籠具內，單籠飼養。動物自由飲水，每只動物每天定量給料和水果各 150 g，自由攝取。食蟹猴飼養于恒溫（16 ~ 26 ℃）、恒濕（40% ~ 70%）的條件下，明暗周期為 12 h，每小時最低換氣次數 8 次。所有研究方案均通過國家藥物安全評價監測中心實驗動物福利倫理委員會（IACUC）的倫理審查。

1.1.2 主要試劑和儀器 流式儀校準微球（BD CalibriteTM3-color、APC bead）、流式檢測抗體FITC-CD8（Clone RPA-T8，批號：37124）、PE-CD4（Clone L200，批號：17206）、PerCP-CD3（Clone SP34-2，批號：2230514）、APC-CD20（Clone 2H7）均購自美國 BD 公司；紅細胞裂解液主要成分：氯化氨（批號：20080228）、碳酸氫鉀（批號：F20101109）、乙二胺四乙酸二鈉（批號：20100324）和多聚甲醛（批號：20111121）購自國藥集團；磷酸鹽緩沖液（批號：AD2016267、AD22391274）購自美國 Hyclone 公司；多聚甲醛使用前經 PBS 稀釋為 1% 或 4% 的應用液。

FACSCalibur 流式細胞儀和分析軟件 Cell QuestTM為美國 BD 公司產品；H-500FRS 高速離心機為日本Kokusan 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 流式樣本制備方法 將CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體組合與 50 μl 抗凝全血加入流式管中，混勻樣本后于室溫、避光條件下孵育 30 min。在流式管中分別加入 1 ml 的紅細胞裂解液并混勻，紅細胞充分裂解后，以 200 ×離心 5 min，棄上清并加入 1 ml PBS，之后再次以 200 ×離心 5 min 棄上清。當日樣本在采集后4 h 之內完成制備。

1.2.2 比較不同濃度多聚甲醛對結果的影響 取 24 只猴（雌雄各半）肝素抗凝全血 50 μl，分別與 5 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體混合，每組平行設置空白對照。流式樣本制備方法同 1.2.1，樣本分別經濃度為 1% 或 4% 的多聚甲醛溶液固定，制備后于 2 ~ 8 ℃保存。連續4 d 上機測定淋巴細胞熒光強度及 CD3+、CD4+、CD8+、CD20+百分率及 CD4+/CD8+比值。

1.2.3 比較不同體積抗體與全血混合后對結果的影響 取 10 只食蟹猴（雌雄各半）肝素抗凝全血 50 μl，分別與 1、3、5 和 10 μl CD8+-FITC、CD4+-PE、CD3+-PerCP 抗體混合，每組平行設置同型對照。流式樣本制備方法同 1.2.1，樣本使用濃度為 1% 的多聚甲醛溶液固定，制備后于 2 ~ 8 ℃保存。連續 7 d 上機測定 T 淋巴細胞 CD4+和 CD8+熒光強度及 CD4+與 CD8+百分率和 CD4+/CD8+比值。不同樣本抗原表達的熒光強度經標準化處理，得出平均熒光強度（median fluorescence intensity，MFI）后再進行比較。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 多聚甲醛濃度對淋巴細胞亞群分類結果的影響

多聚甲醛主要用于固定保存細胞的原有組織形態，通常使用濃度為 1%，其高濃度通常使用 4%。樣本經濃度為1% 或 4% 的多聚甲醛固定后，分別在制備后連續 4 d 測定其 CD3+%、CD4+%、CD8+%、CD4+/CD8+及 CD3-CD20+%。樣本經 1% 多聚甲醛固定至第 4 天檢測可見雄性動物 CD4+%、CD8+%、CD3-CD20+% 和雌性動物 CD8+% 數值與樣本制備當天的相應數值相比存在顯著性差異（表1，< 0.05，< 0.01），且變化存在時間依賴性。而以 4% 多聚甲醛固定的樣本制備后連續 4 d 各項檢測指標與制備當天相比均未見顯著性變化。此外，樣本保存至第 4 天時以 1% 多聚甲醛保存的樣本 CD4+%、CD8+%、CD3-CD20+% 數值與 4% 多聚甲醛保存的樣本相比亦存在顯著性降低（< 0.05，< 0.01，< 0.001）。上述結果提示多聚甲醛濃度對檢測結果存在一定影響：1% 多聚甲醛固定樣本最多可保存 3 d 進行檢測，而多聚甲醛濃度為 4% 時在樣本制備后 4 d 使用流式計數對不同表面抗原淋巴細胞作分選，仍可獲得穩定數值。

表 1 樣本經 1% 或 4% 多聚甲醛保存不同天數后對結果的影響（）

注：與第 1 天的結果進行比較，*< 0.05，**< 0.01；與相同組別經 1% 多聚甲醛固定樣本數據比較，#< 0.05，##< 0.01，###< 0.001。

Notes: Comparing with the data on the first day,*< 0.05,**< 0.01; Comparing with samples of the group fixed with 1% paraformaldehyde,#< 0.05,##< 0.01,###< 0.001.

表 2 全血中添加不同量抗體測定食蟹猴淋巴細胞亞群結果（）

注：與相同檢測時長稀釋比例為 10:50 的相應指標比較，**< 0.01，***< 0.001；與不同檢測時間相同稀釋比例指標比較，##< 0.01。

Notes: Comparing with samples using antibodies diluted in 10:50 and tested at the same time point,**< 0.01,***< 0.001; Comparing with samples at the same antibodies dilutions but tested at different time points,##< 0.01.

2.2 不同抗體稀釋比例對淋巴細胞亞群分類結果的影響

使用流式法作淋巴細胞亞群分類計數時，建議于 50 μl 抗凝全血中添加 10 μl 抗體。本研究分別比較在 50 μl 抗凝全血中添加 10、5、3 和 1 μl 抗體對CD4+及 CD8+平均熒光強度的影響，從而判斷抗體稀釋濃度差異是否對檢測的靈敏度產生影響。樣本經 1% 的多聚甲醛固定后連續 7 d 使用流式細胞儀檢測（表 2），自制備第4天起，50 μl 抗凝全血中添加1 μl 的全血樣本CD4+平均熒光強度與當天制備的添加 10 μl 抗體的全血的樣本相比存在顯著性差異（< 0.01，< 0.001）。此外，所有樣本至第 4 天起，CD4+及 CD8+平均熒光強度出現顯著衰減（< 0.01），抗體用量越少，衰減程度越高。上述結果提示為保證試驗結果的可靠性，50 μl 全血中至少應添加 3 μl 抗體用于流式檢測，樣本制備后應于 3 d 內完成檢測。

樣本經不同稀釋比例的抗體處理后，分別在處理當天及處理后2 ~ 7 d 測定其CD4+%、CD8+%和 CD4+/CD8+比值（表 3）。不同稀釋比例的抗體保存不同時間后上述指標的測定結果未見顯著性差異。

3 討論

免疫系統涉及多個器官，包括胚胎器官、胸腺、淋巴結、脾、骨髓等，在發育過程中呈終生不斷更新的狀態，故對生物技術藥的免疫毒性進行評價是重點也是難點[9]。非人靈長動物的生物學特征與人類最為接近，尤其是各項免疫系統指標與人體數據的可比性最強，成為生物技術藥物臨床前安全性評價的重要實驗動物[10]。取動物外周血對其淋巴細胞亞群分類計數，從而對動物免疫細胞的形態特征進行動態監控并對免疫功能做出評價，已成為常規而必備的免疫毒性評價指標。尤其是 T 細胞淋巴亞群，對藥物的早期藥效或毒性有提示作用，其在安評領域中的應用愈發受到重視。然而多種因素均可對流式細胞計數結果產生影響，從而影響結果的穩定性和可靠性。如不同廠家及型號流式細胞儀和動物來源均可能對淋巴細胞亞群分析產生影響[11-14]。此外，不同抗凝劑及用量[8]、樣本放置時間[15]及溫度等因素，可能對檢測的靈敏度、表面抗原破壞程度或熒光衰減程度產生影響。屈雪琪等[8]分別在樣本制備后 1 ~ 10 d 內使用 FCM 測定經肝素、EDTA 和枸櫞酸鈉抗凝的樣本的 CD3+、CD4+及 CD8+數值后發現，三種抗凝劑中肝素的抗凝效果最優，應于樣本制備后4 d 內完成檢測。

本研究發現不同多聚甲醛使用濃度、抗體用量及保存時間均對樣本的狀態和試驗結果產生一定影響。多聚甲醛是最常用的組織樣本固定液，甲醛可促使蛋白質的氨基之間交聯形成羧甲基，固定抗原決定簇的三維構象，從而發揮固定細胞表面蛋白的作用[16]。因甲醛可經氧化變為甲酸，從而酸化樣本影響染色效果[17]，故樣本制備后應盡快檢測。結果顯示，雖然 1% 和 4% 的多聚甲醛在檢測當天的效果相當，但流式樣本當天無法測定，可適當提高多聚甲醛濃度。樣本可于4% 濃度的多聚甲醛中在4 ℃條件下保存至制備后第 4 天檢測，其固定效果較 1% 濃度的多聚甲醛更為穩定。此外，本研究數據提示樣本制備時，在 50 μl 全血中應添加至少 3 μl 抗體用于檢測，以保證流式細胞儀對淋巴細胞表型識別的靈敏度，檢測應于樣本制備后 3 d 內完成。流式檢測抗體用量尚存爭議，建議實際工作中使用說明書中抗體推薦量。本研究對正常食蟹猴的淋巴細胞表型檢測結果進行對比研究，因不存在外源性毒性引起的免疫毒性，動物樣本中淋巴細胞數量較多，熒光抗體標記分類明顯；當樣本中淋巴細胞含量較低時，則應慎重降低抗體使用量。本研究使用抗體-熒光素組合為 PE-CD4+/FITC-CD8+，PE 為流式細胞儀較強通道（激光器激發光和發射光波長分別為 480 nm 和 578 nm）[18]，而 CD4+為強表達抗原，兩者結合使用進一步強化 CD4+信號，本研究條件下發現 PE-CD4+數值對外在因素的改變較 FITC-CD8+敏感。樣本經 1% 多聚甲醛固定后，抗體稀釋度對樣本的熒光強度影響較大。保存時間過久或抗體稀釋度過低，可影響抗體與細胞表面抗原的結合度，進而對熒光強度產生影響，故建議所有樣本盡量于制備當天測定。

表 3 使用不同比例稀釋抗體測定食蟹猴 T 淋巴細胞亞群結果（）

綜上所述，試驗條件、實驗室操作技術及操作程序等多種環節均可對淋巴細胞亞群分類結果產生影響，為保證獲得科學而有效的研究數據，有必要在 GLP 工作中不斷積累經驗，完善樣本制備的過程，并嚴格控制儀器條件設置及測定時間等流程，盡量減少各種對于流式測定結果的影響[6,18]。本研究為不同淋巴細胞亞群分類流式檢測條件的可信度提供數據支持。

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Comparison of lymphocyte subsets classification assay conditions based on flow cytometry

JIANG Hua, WEN Hai-ruo, LIU Li, YAN Yu-jing, HUO Yan

Author Affiliation: Key Laboratory of Beijing for Nonclinical Safety Evaluation Research of Drugs, National Center for Safety Evaluation of Drugs, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100176, China

To evaluate the effects of the dilution of antibody and the concentration of paraformaldehyde on the classification results of lymphocyte subsets detected by flow cytometry.

50 μl anti-coagulant whole blood was taken from monkeys and fixed with 1% and 4% paraformaldehyde, and then the fluorescence intensity of T lymphocytes, the percentage of CD3+, CD4+, CD8+and CD20+and CD4+/CD8+were detected by flow cytometry for four days. 50 μl anti-coagulant whole blood was taken from monkeys and mixed with 1, 3, 5 and 10 μl CD8+-FITC, CD4+-PE, CD3+-PerCP antibody respectively, and then the CD4+and CD8+fluorescence intensity of T lymphocytes, the percentage of CD4+and CD8+and CD4+/CD8+were detected by flow cytometry for seven days.

The detection results of the fourth day after preparation of the samples fixed with 1% paraformaldehyde showed that, the percentage of CD4+%, CD8+% and CD3-CD20+% cells from the male animals, and the percentage of CD8+% cells of the female animals were significantly different from that on the day of sample preparation (< 0.05 and< 0.01, respectively) with time-dependent effect. CD4+%, CD8+%, CD3-CD20+% cells in the samples stored in 1% paraformaldehyde on the fourth day were significantly lower than that in the samples stored in 4% paraformaldehyde (< 0.05 and< 0.001, respectively) as well. When 1 μl antibody was added to 50 μl anticoagulated whole blood, the median fluorescence intensity of CD4+was significantly lower than that on the date of preparation (< 0.01). From the fourth day, the median fluorescence intensities of CD4+and CD8+was significantly attenuated (< 0.01).

The antibody dilution and the concentration of paraformaldehyde determine the state of the sample and the detection results. If the samples could not be detected on the day of preparation, it should be stably stored in 4% concentration of paraformaldehyde at 4 ℃ until the fourth day after preparation. When the antibody dilution was no less than 3:50, the sensitivity of lymphocyte recognition to the cell phenotype could be ensured, and the detection should be completed within 3 days after preparation.

Flow cytometry; Antibody; Lmphocytes subsets; Cynomolgus monkeys; Paraformaldehyde

HUO Yan, Email: yanhuo@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.003

“重大新藥創制”國家科技重大專項（2015ZX09501007-004、2018ZX09201-017）；國家重點研發計劃（2016YFA0101503）

霍艷，Email：yanhuo@nifdc.org.cn

2019-07-11

*同為第一作者