活性氧在七氟烷致人口腔鱗狀細胞癌凋亡中的作用研究

趙晨璐，高銀亮，張國慶

活性氧在七氟烷致人口腔鱗狀細胞癌凋亡中的作用研究

趙晨璐，高銀亮，張國慶

463000 河南省駐馬店市中心醫院麻醉科

研究七氟烷在人口腔鱗狀癌細胞中的抗癌作用及其潛在的分子機制。

MTT 實驗表明七氟烷能夠抑制多種人口腔鱗狀癌細胞的增殖，并且通過降低線粒體膜電位，調節人口腔鱗狀癌細胞中 Bcl-2 家族、caspase-3 和 PARP 蛋白的表達，最終誘導細胞凋亡。七氟烷還促進了人口腔鱗狀癌細胞中活性氧的積累，并上調 JNK、p53 蛋白的磷酸化表達水平，激活 JNK/p53 信號通路。然而，在加入 NAC 之后，不但細胞凋亡情況被抑制，JNK/p53 信號通路的激活也被顯著逆轉。

七氟烷通過調節活性氧水平來激活人口腔鱗狀癌細胞中的 JNK/p53 信號通路從而誘導細胞凋亡，因此七氟烷有成為治療人口腔鱗狀癌的備選藥物的潛力。

活性氧； JNK 絲裂原活化蛋白激酶類； 腫瘤抑制蛋白 p53； 細胞凋亡； 原代口腔鱗狀細胞癌細胞； 七氟烷

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）指發生于口腔內，以鱗狀細胞為主的惡性腫瘤，常發生于牙齦、硬腭、頰黏膜、嘴唇等多器官，在所有惡性腫瘤的發病率中占 2% ~ 4%，屬于頭頸部惡性程度最高、危害性最大的腫瘤[1-3]。目前，口腔鱗狀細胞癌雖然在治療方法上取得了很大進展，但是發病率和病死率仍然居高不下，5 年存活率小于 50%，嚴重威脅人類的生命健康，尋找低毒有效的抗癌藥物來治療口腔鱗狀細胞癌具有十分重要的意義[4]。

七氟烷為無色透明、無刺激性的揮發性液體，是一種吸入性麻醉藥，能夠迅速、平穩地進行麻醉誘導和維持，已經被廣泛應用于多種惡性腫瘤的手術治療[5]。近年來，越來越多的研究表明手術中吸入性麻醉藥的選擇不僅僅對麻醉本身產生影響，而且對腫瘤細胞的生物學行為也有影響，繼而影響惡性腫瘤的復發及預后[6]。有研究表明，七氟烷能夠促進乳腺癌 MCF-7 細胞和膠質瘤干細胞的增殖[7]；但是七氟烷能夠在體外抑制人結腸癌細胞株Caco-2 和 SW-620 的增殖，并通過下調細胞周期調節蛋白的表達使細胞阻滯在 G2/M 期，從而抑制 A549 細胞的增殖[8]。在七氟烷對腫瘤細胞凋亡的影響方面，七氟烷可以抑制乳腺癌細胞的凋亡，促進肺癌細胞和結腸癌細胞的凋亡[9]，并且能夠明顯抑制肺癌、結腸癌的侵襲和遷移[10-11]。綜上所述，七氟烷對各類癌癥細胞增殖的影響各有不同，且尚未見七氟烷對口腔鱗狀細胞癌的報道，因此本文就七氟烷對口腔鱗狀細胞癌的增殖、凋亡等生物學行為的影響及其機制進行研究，以期為七氟烷在臨床上的應用提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口腔鱗狀細胞癌細胞的獲取 原代口腔鱗狀細胞癌細胞標本取自河南省駐馬店市中心醫院收治的 1 例患者，男，52 歲，因“右舌疼痛性腫塊”入院接受手術治療，在知情同意的情況下，獲取其手術標本，患者及家屬均簽署知情同意書，并經河南省駐馬店市中心醫院倫理部門審核。人口腔鱗狀細胞癌 Cal27、Tca8113 細胞系，人胚肺成纖維細胞 IMR-90，人正常肝 QSG-7701 和人正常腎 293T 細胞系購自于中國科學院細胞研究所。

1.1.2 藥品與試劑 七氟烷購自日本丸石制藥株式會社；5-氟尿嘧啶（5-FU）、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 培養基、RPMI1640 培養基、胎牛血清（FBS）均購自美國 Sigma 公司；噻唑藍（MTT）購自美國 Amresco 公司；青-鏈霉素青鏈雙抗（PS）、胰蛋白酶（TE）和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國 Hyclone 公司；AnnexinV/PI 試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司；α-tubulin、Bad、Bcl-2、caspase-3、PARP、JNK、p-JNK、p38、p-p38 抗體、HRP 標記山羊抗兔 IgG 和 HRP 標記山羊抗鼠 IgG 均購自美國 Santa 公司；2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）和 ECL 化學發光試劑均購自君瑞生物技術有限公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 無菌條件下，取腫瘤標本，去除多余組織，PBS 反復沖洗，剪成 1 ~ 2 mm3小塊，間距為 8 mm，平鋪于培養瓶底部，倒置于37 ℃、5% CO2的培養箱中；靜置 3 h 后，換液，正置于 37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。當從組織塊爬出的細胞長到覆蓋瓶底 90% 以上時，按照 1:3 比例傳代。細胞生長匯合后棄去培養液，用 PBS 沖洗 2 次，加入 0.25% 胰蛋白酶 1 ml。用酶消化法去除梭形成纖維細胞，隨后傳代培養。

社會公共資產的載體是在各級民政部門登記注冊的社會團體、基金會、社會服務機構的社會組織。社會公共資產與企業國有資產、政府性資產雖然都為社會提供公共產品或準公共產品，都具有“公有”資產形式，但資產屬性、管理方式、產權結構等方面并不全然相同。政府性資產以“政府公共資產”冠之更為恰當，它以社會福利最大化和政治、經濟制度穩固為主要目標等。社會公共資產以社會服務、社會治理、社會資本增值、滿足公民訴求、保障公民利益等為目標，是一種特殊的所有權形式。

人口腔鱗狀細胞癌 Tca8113 細胞、人正常肝 QSG-7701 和人正常腎 293T 細胞用含 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素及 100 μg/ml 鏈霉素的 RPMI1640 培養液培養；人口腔鱗狀細胞癌 Cal27 和人胚肺成纖維細胞IMR-90 細胞用含 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素及 100 μg/ml 鏈霉素的 DMEM 培養液培養，在 37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。待細胞至對數生長期的時候，按照比例進行傳代培養。

1.2.2 MTT 比色法檢測七氟烷對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖的影響 將生長狀態良好且處于對數生長期的原代人口腔鱗狀細胞癌細胞（GAS）、Cal27 細胞、Tca8113 細胞和人正常肝 QSG-7701 和人正常腎 293T 細胞分別制成細胞數為 1 × 105個/ml 的細胞懸液，并接種至 96 孔板中，10 000 個/孔。處理 24 h 后用 1% FBS 的培養液饑餓 2 ~ 4 h。每孔加入 1 μl 不同濃度（1、3、10、15 及 20 μmol/L）的七氟烷，陽性對照組做同樣濃度的處理，以上實驗組均設定 8 個復孔并設定一個空白調零孔。加藥 24 h 后將 15 μl 0.5% 的 MTT 溶液加入孔中并放入培養箱繼續孵育，2 h 后將上清液吸出，加入 DMSO，利用酶標儀在 490 nm 波長下測量吸光度值，實驗重復 3 次并計算細胞存活率及 IC50值。七氟烷對各個細胞增殖抑制作用以細胞存活率來進行衡量，計算式如下所示：

增殖抑制率=[1 –（實驗組490– 空白調零組490）/（未加藥處理組490– 空白調零組490）]× 100%。

1.2.3 Hochest/PI 雙染法檢測七氟烷對口腔鱗狀細胞癌細胞形態的影響 將 5 × 105/ml 的原代口腔鱗狀細胞癌細胞懸液 1 ml 接種于 6 孔板中，待細胞貼壁后按不同時間梯度（3、6、12、24 h）倒序加入七氟烷，藥物濃度為 IC50值，待處理時間達到后，棄去 6 孔板中的培養液，加入 0.5 ml 的多聚甲醛固定液，固定半小時后，利用 PBS 洗滌，隨后加入 1 ml 的 Hoechst 33258 染色液，搖床輕晃，染色 10 min 后；用 PBS 洗滌 2 次，隨后在熒光顯微鏡下檢測拍照。

1.2.4 流式細胞術檢測七氟烷對口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡及線粒體膜電位的影響 取對數生長期的原代口腔鱗狀細胞癌細胞，以適當密度接種于6 孔板，當細胞密度達 70% 后，按不同時間梯度（3、6、12、24 h）倒序加入七氟烷，藥物濃度為 IC50值，待處理時間達到后，棄去 6 孔板中的培養液，分別收集孔中的上清至 Tube 管中，將細胞用不含 EDTA 的 TE 消化并收集到對應的 Tube 管。預冷的 PBS 洗滌 10 min，每管細胞沉淀中加 100 μl 的細胞結合液，充分吹打混勻。每管加 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，室溫避光染色 30 min，最后用細胞結合液體將流式管補至 500 ml，隨后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡，并利用 CytExpert 軟件進行分析。

進一步檢測線粒體膜電位的變化，種板、加藥、處理及收集步驟同上，PBS 重懸細胞后，室溫下避光放置 5 min，隨后將 JC-1 加入管中使其終濃度為 0.5 μmol/L。隨后避光染色 0.5 h，隨后用 PBS 洗 1 次，并用 PBS 進行重懸至 500 μl，立即上流式細胞儀檢測 ΔΨm 的變化情況。利用 CytExpert 軟件進行，當 ΔΨm 較高時，JC-1 聚集在線粒體基質中，形成聚合物，產生紅色熒光。當 ΔΨm 較低時，JC-1 為單體，產生綠色熒光。

1.2.5 流式細胞術檢測七氟烷對口腔鱗狀細胞癌細胞內活性氧水平及凋亡的影響 用 IC50值為終濃度的七氟烷分別處理細胞 3、6、12 和 24 h 后，將細胞收集到 Tube 管中，離心并棄去上清，加 PBS 重懸并洗滌一次，隨后將 5 μl 的 DCFH-DA加入重懸液中，放入 37 ℃恒溫水浴鍋，避光孵育 0.5 h，離心后用 PBS 重懸洗滌一次，最后用 500 μl PBS 重懸細胞，并轉移至流式管后流式細胞儀檢測細胞內活性氧水平。

進一步檢測加入 N-乙酰半胱氨酸（NAC）之后七氟烷對口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡變化情況，將生長狀態良好的 AGS 細胞以 1 × 105/孔的密度接種至 6 孔板培養 1 d 后。終濃度為 5 mmol/L 的 NAC 預處理 0.5 h 后，用 IC50值為終濃度的橙皮苷處理 AGS 細胞。24 h 后收集細胞并經過 PBS 清洗后，按照 Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒的操作方法，分別加入 Annexin V-FITC 結合液，Annexin V-FITC 和 PI，常溫黑暗環境下孵育15 min 后，將 300 μl PBS 加入其中，隨后轉移至流式管利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 Western blot 檢測蛋白變化情況 取對數生長期的原代口腔鱗狀細胞癌細胞，以適當密度接種于 6 孔板，當細胞密度達 70% 后，按不同時間梯度（3、6、12、24 h）倒序加入七氟烷，藥物濃度為 IC50值，待達到處理時間后，棄去 6 孔板中的培養液，分別收集孔中的上清至 Tube 管中，將細胞用不含 EDTA 的 TE 消化并收集到對應的Tube 管。將含有蛋白酶抑制劑的裂解液加入 Tube 管中，冰上裂解 30 min，冷凍離心機 12 000 r/min 離心 30 min，取上清，利用考馬斯亮藍法和分光光度計對蛋白進行定量分析，隨后取 20 μl 總蛋白進行 SDS-PAGE，隨后轉移至硝酸纖維素膜上，隨后用脫脂奶粉的封閉液室溫封閉 2 h，加入對應的一抗 4 ℃孵育過夜；次日用 TBST 洗 5 次，5 min/次，二抗室溫孵育 2 h，TBST 洗 5 次，5 min/次。利用 ECL 顯色液在化學發光圖像分析系統中曝光成像。Image J 軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白和內參蛋白條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學處理

Figure 1 Inhibition of sevoflurane on proliferation of human oral squamous cell carcinoma cells and normal cells (A: Killing effect of sevoflurane and 5-FU on three oral squamous cell carcinoma cells; B: Killing effect of sevoflurane and 5-FU on three normal cells;*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001, compared with control group; n = 3)

2 結果

2.1 七氟烷對人口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖抑制作用

用不同濃度（1、3、10、15、20 μmol/L）的七氟烷和 5-FU（陽性對照組）分別處理原代口腔鱗狀細胞癌細胞、Tca8113 及 Cal27 細胞 24 h 后，進行 MTT 實驗。如圖 1A 所示，隨著七氟烷藥物濃度的逐漸增加，四種口腔鱗狀細胞癌細胞存活率明顯降低并呈明顯的濃度依賴性。七氟烷與陽性對照組 5-FU 相比對三種人口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖抑制作用更明顯，具有顯著性差異（< 0.05）。經計算，七氟烷對三種人口腔鱗狀細胞癌細胞的 IC50值分別為 8.23 ± 0.9、13.56 ± 2.9 和 12.87 ± 2.5 μmol/L。如圖 1B 所示，在對三種人正常細胞的 MTT 檢測中，同濃度的七氟烷較 5-FU 對正常細胞的殺傷作用小。

圖 2 七氟烷對原代口腔鱗狀細胞癌細胞形態的影響

Figure 2 Effect of sevoflurane on cell morphology of human oral squamous cell carcinoma cells

2.2 七氟烷對原代口腔鱗狀細胞癌細胞形態的影響

用終濃度為 8 μmol/L 的七氟烷和 5-FU 處理細胞 0、3、6、12 和 24 h 后，通過 Hochest/PI 雙染法對細胞進行染色處理，并在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度及明場條件下的細胞形態變化。從圖 2 中可以看出明場條件下，未經七氟烷處理的細胞大小均一，形態規則，細胞邊緣光滑平整，單層生長，貼壁狀態良好，但是隨著七氟烷處理時間的不斷增加，細胞邊緣逐漸皺縮，細胞體積變小，細胞核體積增大，顆粒感增強，懸浮細胞增多，出現細胞凋亡的形態，其中處理時間 24 h 最為明顯。在熒光條件下，細胞的紅色熒光強度隨著七氟烷的處理時間逐漸增強；另一方面，與陽性對照藥物 5-FU 相比，七氟烷對原代口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡形態出現變化的時間更早。

圖 3 七氟烷通過線粒體依賴性途徑誘導人口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡（A：流式細胞術檢測細胞凋亡率；B：流式細胞術檢測線粒體膜電位變化情況；C：Western blot 檢測凋亡相關蛋白的變化；*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，以0 h 為對照組；n = 3）

Figure 3 Sevoflurane induces apoptosis in human oral squamous cell carcinoma cells via a mitochondial-dependent pathway(A: Flow cytometry to detect apoptosis rate; B: Detection of mitochondrial membrane potential changes by flow cytometry; C: Western blot analysis of changes in apoptosis-related proteins;*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001, compared with control group; n = 3)

2.3 七氟烷通過線粒體依賴性途徑誘導原代口腔鱗狀細胞癌凋亡

如圖 3A 所示，七氟烷可顯著提高凋亡細胞百分比，細胞凋亡率由（1.03 ± 0.14）% 提高到（60.51 ± 3.28）%，另外，JC-1 用于檢測線粒體膜電位的變化。如圖 3B 所示，隨著七氟烷處理時間的增加，細胞的線粒體膜電位相應降低。隨后檢測了線粒體凋亡相關蛋白的表達。如圖 3C 所示，七氟烷導致 Bad、cle-caspase-3 和 cle-PARP 蛋白的表達水平增加，Bcl-2 蛋白表達水平降低。

2.4 JNK/p53 信號通路參與七氟烷誘導的原代口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡

如圖 4A 所示，七氟烷處理后 p-JNK 的表達水平下調。相反，p-p53 的表達水平上調。此外，為了進一步證實 JNK 和 STAT3 途徑與七氟烷誘導的細胞凋亡的關系，我們用 12 μmol/L JNK 抑制劑SP600125 預處理細胞 30 min，然后用 6 μmol/L七氟烷處理細胞 24 h。如圖 4B 所示，用 JNK 抑制劑處理后，p-p53 和 caspase-3 的表達水平受到抑制。這些結果表明，JNK 信號通路處在 p53 信號通路的上游，并調節 p53 信號通路，并與七氟烷誘導的細胞凋亡密切相關。

2.5 七氟烷調節原代口腔鱗狀細胞癌中的活性氧水平來誘導細胞凋亡

如圖 5A 和 5B 所示，七氟烷處理原代口腔鱗狀細胞癌細胞后活性氧的水平顯著增加，并且用 NAC 預處理引起七氟烷誘導的原代口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡被明顯抑制。此外，細胞凋亡相關蛋白進一步測試驗證活性氧在七氟烷誘導的細胞凋亡中的作用。如圖 5C 所示，加入 NAC 后顯著逆轉了 p-JNK、p-p53 蛋白表達水平，同時降低了 cle-caspase-3 和 cle-PAPR 的表達水平，升高了Bcl-2 的表達水平。這些結果表明活性氧的產生參與了七氟烷誘導的原代口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡。

圖4 JNK/p53 信號通路參與七氟烷誘導的人口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡（A：Western blot 檢測 JNK/p53 信號通路相關蛋白的變化；B：Western blot 檢測 JNK 和 p53 信號通路的關系；**P < 0.01，***P < 0.001，以 0 h 為對照組；n = 3）

Figure 4 JNK/p53 signaling pathway is involved in sevoflurane-induced apoptosis in human oral squamous cell carcinoma cells (A: Western blot analysis of changes in JNK/p53 signaling pathway-associated proteins; B: Western blot analysis of the relationship between JNK and p53 signaling pathway;**< 0.01,***< 0.001, compared with control group; n = 3)

圖 5 七氟烷調節人口腔鱗狀細胞癌中的活性氧水平來誘導凋亡（A：流式細胞術檢測細胞中活性氧水平變化情況；B：流式細胞術檢測 NAC 對細胞凋亡的影響；C：Western blot 檢測活性氧對 JNK/p53 信號通路的調控作用；**P < 0.01，***P < 0.001，以 0 h 為對照組；n = 3）

Figure 5 Sevoflurane regulates ROS levels in human oral squamous cell carcinoma cell to induce apoptosis (A: Flow cytometry to detect changes in reactive oxygen species in cells; B: Flow cytometry to detect the effect of NAC on apoptosis; C: Western blot analysis of the regulation of reactive oxygen species on JNK/p53 signaling pathway;**< 0.01,***< 0.001, compared with control group; n = 3)

3 討論

目前的癌癥治療是以化療為主，手術治療及放射治療為輔的多手段協同治療，其中化療藥物的選擇就成了癌癥治療的核心要素[12]。七氟烷因其豐富的生物活性和藥理活性而備受關注，七氟烷在臨床上被廣泛應用于全身麻醉及手術麻醉，是最接近理想的吸入麻醉藥[7]。有研究表明，七氟烷具有抑制多種癌細胞增殖的能力，但是目前沒有報道過七氟烷對人口腔鱗狀癌細胞是否具有作用，因此本實驗中選取了人口腔鱗狀細胞癌進行了研究。結果表明七氟烷顯著抑制三種人口腔鱗狀癌細胞的增殖，對人胚肺成纖維細胞 IMR-90、人正常肝 QSG-7701 和人正常腎 293T 細胞的殺傷作用小于 5-FU。為了進一步證實抑制人口腔鱗狀癌發展的潛在分子機制，選取原代口腔鱗狀細胞癌細胞進行了細胞凋亡、信號通路及活性氧水平檢測。

細胞凋亡是人體抑制腫瘤發展的最重要途徑之一。因此，通過細胞凋亡來抑制癌細胞的增殖遷移等能力是開發抗癌藥物的必要條件[13]。細胞凋亡由內在線粒體途徑和外源死亡受體途徑激活。Bcl-2 家族是線粒體依賴性凋亡途徑的關鍵調節因子，包括 Bad 和 Bcl-2 等蛋白分子。一些研究表明，當細胞內動態平衡略有變化時，這些 Bcl-2 家族蛋白可能抑制或促進癌細胞凋亡[14]。眾所周知，caspase-3 作為細胞凋亡過程的執行者，主要引起線粒體介導的細胞凋亡或破壞線粒體膜電位。有研究報道七氟烷能夠依賴于Bcl-2/Bax 調節的通路和激活裂解的 caspase-3 和 PARP 來誘導宮頸癌細胞凋亡[15]。同樣，我們目前的數據表明七氟烷可以通過增加 Bad、cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP 的表達，同時降低 Bcl-2 的表達，從而誘導原代口腔鱗狀細胞癌細胞線粒體膜電位降低并導致細胞凋亡。因此，七氟烷對人口腔鱗狀癌細胞增殖抑制作用可能是通過調節線粒體凋亡途徑來實現的。

JNK 信號通路能夠參與各種類型癌癥的細胞增殖、存活和凋亡，并已被公認為癌癥治療的潛在分子靶點，磷酸化的 JNK 能夠誘導細胞周期停滯和細胞凋亡來調節各種癌癥中的腫瘤發展[16]；p53 是一種腫瘤調節基因，能夠促進癌細胞發生細胞凋亡，在所有惡性腫瘤中，大部分都會出現 p53 基因的突變，有學者認為 p53 還可直接刺激線粒體釋放高毒性的氧自由基來引發凋亡[17]。因此在誘導凋亡中檢測磷酸化的 JNK 和磷酸化的 p53 的變化是非常有必要的。并且有研究指出，JNK 信號通路能夠調控 p53 信號通路，磷酸化的 JNK 能夠激活 p-p53 的表達，進而誘導細胞凋亡的發生。在本實驗中，我們發現，隨著七氟烷加藥時間的增加，p-JNK 和 p-p53 的表達量升高，說明七氟烷激活了原代口腔鱗狀細胞癌細胞中的 JNK 和 p53 信號通路。隨后我們進一步檢測了兩者之間的關系，加入 JNK 信號通路抑制劑SP600125 之后，我們發現 p-p53 的表達被抑制，說明 JNK 信號通路激活 p53 信號通路進而誘導細胞凋亡的發生。

越來越多的報道表明，活性氧的產生在誘導癌細胞凋亡中起著至關重要的作用，活性氧誘導的細胞凋亡參與多種癌癥的發生和發展。另外，研究表明，許多化學治療劑通過促進各種腫瘤細胞中的活性氧生成來誘導細胞凋亡[18]。本研究的結果表明，七氟烷處理顯著增加了原代口腔鱗狀細胞癌細胞中的活性氧積累。隨后，為了研究活性氧是否參與七氟烷誘導的細胞凋亡，我們用活性氧清除劑 NAC 預處理細胞后加入七氟烷，數據表明加入 NAC 后明顯逆轉了七氟烷誘導的細胞凋亡，并且在蛋白水平上抑制了 cle-caspase3 和 cle-PAPR 的表達升高，抑制了 Bcl-2 表達水平的降低。此外，之前的研究表明，各種應激刺激，如活性氧引起的氧化應激，可能導致 JNK 通路的激活；另一方面，活性氧與抗癌藥物誘導的細胞凋亡有關，可能是通過調節 p53 信號通路來實現的。最近的一項研究表明活性氧產生誘導細胞凋亡并激活口腔鱗癌細胞中的 JNK 和 p53 信號通路。為了驗證七氟烷誘導的活性氧水平升高在口腔鱗癌細胞中是否調節了 JNK 和 p53 信號通路，我們通過 Western blot 實驗檢測了加入活性氧清除劑之后 JNK 和 p53 磷酸化表達量變化情況，從實驗結果中可以看出，NAC 和七氟烷共同處理組的 p-JNK 和 p-p53 的表達量較七氟烷單獨處理組降低，說明 NAC 在清除了細胞中的活性氧之后又抑制了 JNK/p53 信號通路的激活，說明活性氧在七氟烷誘導的凋亡中處在最上游，調控 JNK/p53 信號通路。

在本研究中，證明了七氟烷誘導口腔鱗癌細胞凋亡的分子機制，即七氟烷促進活性氧的產生并進一步介導 JNK/p53 信號通路的激活，提供了七氟烷可作為治療人類口腔鱗癌的潛在治療劑的證據。

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The role of reactive oxygen species in the apoptosis of human oral squamous cell carcinoma cells induced by sevoflurane

ZHAO Chen-lu, GAO Yin-liang, ZHANG Guo-qing

Author Affiliation: Anesthesiology Department, Zhumadian Central Hospital, Henan 463000, China

Sevoflurane is a commonly used anesthetic drug in clinical practice. It has a variety of pharmacological activities and can inhibit the proliferation of various cancer cells, but its effect on human oral squamous cell carcinoma is still unclear. In this study, we studied the anticancer effect of sevoflurane in human oral squamous cell carcinoma and its underlying molecular mechanism.

MTT colorimetric assay was used to detect the inhibitory effect of sevoflurane on human oral squamous cell carcinoma. Hochest/PI double staining and flow cytometry were used to detect the apoptosis of human oral squamous cell carcinoma cells induced by sevoflurane, the level of reactive oxygen species and apoptosis after the addition of reactive oxygen scavenger NAC. Western blot experiments were used to detect related proteins.

Sevoflurane inhibited the proliferation of human oral squamous cell carcinoma cells and regulated the expression of Bcl-2 family, caspase-3 and PARP proteins in the cells by decreasing mitochondrial membrane potential, and eventually induced apoptosis. Sevoflurane also promoted the accumulation of ROS in human oral squamous cell carcinoma cells, up-regulated the levels of JNK and p53 phosphorylation, and activated the JNK/p53 signaling pathway. However, after the addition of the ROS scavenger NAC, not only the apoptosis was inhibited, but the activation of the JNK/p53 signaling pathway was also significantly reversed.

Sevoflurane activates JNK/p53 signaling pathway in human oral squamous cell carcinoma cells by the increment of ROS levels and the induction of apoptosis. Therefore, sevoflurane can be potentially used as a treatment for human oral squamous cell carcinoma.

Reactive oxygen species; JNK mitogeu-activiater protein kinases; Tumor suppressor protein p53; Apoptosis; Primary oral squamous cell carcinoma cell; Sevoflurane

ZHANG Guo-qing, Email: zgq396650@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.006

張國慶，Email：zgq396650@sina.com

2019-06-17