Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化酒黃精多糖的超聲提取工藝及其抗氧化活性研究

蔡興航,謝 培，史鑫波，侯 青，黃文靜

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000)

黃精是作為大宗藥食同源植物之一，化學(xué)成分主要包括多糖、甾體皂苷、生物堿、木脂素、黃酮等，其中多糖和甾體皂苷類(lèi)成分在黃精中含量較大，為其主要藥效成分[1-6]。黃精多糖具有調(diào)節(jié)免疫力、改善記憶功能、抗抑郁、降血糖、調(diào)血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[7-13]。黃精經(jīng)酒制后，不僅可以消除刺激性，而且能增強(qiáng)補(bǔ)益療效[14]，經(jīng)推斷或與酒黃精中新的化合物有關(guān)[15]。目前，鮮有酒黃精多糖抗氧化研究報(bào)道，所以本研究擬酒黃精為研究對(duì)象，通過(guò)超聲波法對(duì)酒黃精多糖進(jìn)行提取，并用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，通過(guò)評(píng)價(jià)酒黃精多糖對(duì)DPPH自由基清除率，以及對(duì)SW620細(xì)胞抗氧化活性的影響，探尋酒黃精多糖的抗氧化作用，為酒黃精多糖的深層次開(kāi)發(fā)提供有效的技術(shù)支持。

1 材料

實(shí)驗(yàn)所用材料購(gòu)于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司。由陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍副教授鑒定為酒黃精飲片。無(wú)水D-葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)110833-201205，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。濃硫酸、苯酚購(gòu)于天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 酒黃精多糖的制備

將酒黃精樣品用粉碎機(jī)粉碎，用石油醚回流脫脂2次，每次回流3 h。稱(chēng)取10 g脫脂酒黃精，以水為介質(zhì)，按一定料液比、超聲時(shí)間、溫度提取，真空抽濾，離心去沉淀取上清液，用Sevage試劑(氯仿-正丁醇4:1)脫蛋白3次，溶液離心15 min(4 000 r·min-1)，所得上清液進(jìn)行抽濾，抽濾的上清液用4倍量80%乙醇沉淀，最后冷凍干燥沉淀物為酒黃精多糖[16]，待用時(shí)，用蒸餾水配比為一定濃度。

2.2 酒黃精多糖的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行酒黃精多糖測(cè)定，參照杜鵬瑤等[17]的方法，略有修改。稱(chēng)取25 mg葡萄糖溶解于適量的水中，然后定容于250 mL容量瓶中，配置成濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于25 mL刻度試管中，依次加蒸餾水使其定容至2 mL，另以2 mL蒸餾水作為空白對(duì)照。然后加入1 mL濃度為5%的苯酚溶液，繼續(xù)加入5 mL濃硫酸，置入4℃水浴中10 min，取出置于室溫。每個(gè)刻度試管中取出200 μL溶液加入96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，所制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=14.388x+0.1073，R2=0.999，線性關(guān)系良好。

酒黃精多糖含量的測(cè)定：取2 mL上述樣品，加入1 mL濃度為5%的苯酚溶液，混勻，在加入5 mL濃硫酸溶液，搖勻放入冰水浴中10 min，取出放置室溫，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)其吸光度值。利用所得方程式計(jì)算出黃精多糖的得率，計(jì)算公式如下：

酒黃精多糖提取率(%)=(葡萄糖質(zhì)量濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積)/樣品質(zhì)量×100%

2.3 單因素試驗(yàn)

按照“2.1、2.2”項(xiàng)工藝流程，每次稱(chēng)取10 g酒黃精預(yù)處理粉末，考察3個(gè)因素對(duì)酒黃精多糖提取率的影響。單因素條件如表1所示。

表1 單因素條件

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，確定提取料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、超聲溫度(C)3個(gè)因素，用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化3因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)因素水平及編碼

2.5 酒黃精多糖抗氧化活性的研究

2.5.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 參照許女和馮書(shū)珍兩人[18-19]的方法進(jìn)行DPPH自由基清除測(cè)定，取1 mL不同質(zhì)量濃度的酒黃精多糖溶液，加入1 mL用無(wú)水乙醇作為溶劑制成0.1998 mmol·L-1DPPH溶液，置于避光條件下30 min，取200 μL待測(cè)液加入酶標(biāo)板中，用全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定其吸光度(AS)，無(wú)水乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液測(cè)定AC，蒸餾水代替酒黃精多糖溶液測(cè)定A0。清除率計(jì)算公式如下：

清除率/%=1-(AS-AC)/A0×100%

2.5.2 酒黃精多糖提取物對(duì)細(xì)胞抗氧化活性的作用 酒黃精多糖的細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)采用Wolfe的方法[20]。將100μL培養(yǎng)好的SW620細(xì)胞接種于96孔板中(每孔細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)為6×104個(gè))，每個(gè)濃度樣品重復(fù)4個(gè)平行，放置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)20 h，然后取出棄去上清液，用無(wú)血清培養(yǎng)基將每孔各清洗一次。然后各孔依次加入用100 μl完全培養(yǎng)基配制的不同濃度的酒黃精多糖提取物和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液，空白各孔和對(duì)照各孔加入完全培養(yǎng)基替代樣品提取液。將96孔板繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后取出并棄掉各孔上清液，每孔加入100 μL PBS鹽水清洗一次，每孔再分別加入100 μL濃度為600 μmol·L-1的AAPH溶液(空白孔加入濃度為10 mmol·L-1Hepes的HBSS溶液)，然后用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)各孔熒光值，按照標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法檢測(cè)細(xì)胞抗氧化活性(CAA值)，并以μmol槲皮素當(dāng)量/100 g樣品(μmol QE/100 g樣品)來(lái)表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同提取條件下單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

料液比對(duì)酒黃精多糖得率的影響如圖1所示。當(dāng)料液比在1:20～1:30(g·mL-1)之間時(shí)，得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1:30(g·mL-1)時(shí)，得率為7.6%，達(dá)到最大，；當(dāng)料液比在1:30～1:40(g·mL-1)之間時(shí)，得率隨料液比的增加而下降，因此以料液比為1:30最為合適。

圖1 料液比對(duì)酒黃精多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)酒黃精多糖得率的影響如圖2所示。當(dāng)超聲時(shí)間在20～30 min范圍內(nèi)時(shí)，得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，得率為7.56%，達(dá)到最大；當(dāng)超聲時(shí)間在超過(guò)30 min，得率隨時(shí)間的增加而下降；可能是因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲破壞了多糖分子鏈穩(wěn)定性，導(dǎo)致得率降低，因此，超聲時(shí)間為30 min最為合適。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)酒黃精多糖得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)酒黃精多糖得率的影響如圖3所示。當(dāng)超聲時(shí)間在30～40℃范圍內(nèi)時(shí)，得率隨超聲溫度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)超聲溫度為40℃時(shí)，得率為7.52%，達(dá)到最大；當(dāng)超聲溫度在40～50℃范圍內(nèi)時(shí)，得率隨溫度的增加而下降；因此，超聲時(shí)間為40℃最為合適。

圖3 超聲溫度對(duì)酒黃精多糖得率的影響

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析 采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，根據(jù)表1中3因素3水平編碼設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，結(jié)果與分析如表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 酒黃精多糖提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)Design-Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得料液比、超聲時(shí)間和溫度對(duì)酒黃精多糖提取率影響的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=7.58-0.018A-0.056B-0.036C-0.042AB-0.018AC-0.06BC-0.2A2-0.13B2-0.076C2。由表3可知，該模型達(dá)極顯著水平(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.5991>0.05)。所以，該二次方程模型擬合度較好，能夠準(zhǔn)確反映3因素對(duì)酒黃精多糖提取率的影響，表明此模型適用于工藝優(yōu)化。從表3可以看出，一次項(xiàng)B和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)，一次項(xiàng)C和交互項(xiàng)BC對(duì)響應(yīng)值影響顯著(P<0.05)，一次項(xiàng)A和交互項(xiàng)AC、AB對(duì)響應(yīng)值影響不顯著(P>0.05)。通過(guò)比較個(gè)性F值可知，對(duì)酒黃精多糖提取率影響最大的是超聲時(shí)間，其次是超聲溫度，最小的是料液比。

表4 回歸模型的方差分析

注：##P<0.01，差異極顯著；#P<0.05，差異顯著。

3.2.2 響應(yīng)面圖分析 通過(guò)多元回歸方程作三維效應(yīng)曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4可以直觀分析三個(gè)因素之間交換作用以及對(duì)多糖得率的影響。

由圖4可知，A與B、A與C對(duì)酒黃精多糖得率的影響均不顯著(P>0.05)，B與C交互作用顯示，B變化曲面比C變化曲面陡峭；等高線沿B方向變化稍高于C方向呈橢圓形，表明B對(duì)響應(yīng)值的影響比C稍大，二者之間交互作用顯著(P<0.05)。

圖4 A與B、A與C、B與C對(duì)酒黃精多糖提取率的響應(yīng)面圖和等高線

3.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面分析確定最佳工藝參數(shù)為：料液比為1∶32.84(g·mL-1)，超聲時(shí)間為28.69 min，超聲溫度38.99℃，對(duì)應(yīng)酒黃精多糖提取率為7.52%。考慮試驗(yàn)操作的方便性，調(diào)整各因素為整數(shù)，料液比為1∶33(g·mL-1)，超聲時(shí)間為29 min，溫度39℃，在上述條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出酒黃精多糖實(shí)際得率為(7.49±0.08)%，與回歸方程預(yù)測(cè)值基本符合，所以該模型有效。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 酒黃精多糖對(duì)DPPH清除作用 從圖7可知，酒黃精多糖濃度與DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢(shì)，在從0.2～0.92 mg·mL-1范圍內(nèi)呈一定量效關(guān)系。當(dāng)酒黃精多糖質(zhì)量濃度為0.9104 mg·mL-1時(shí)清除達(dá)到76.50%。

圖5 不同濃度酒黃精多糖對(duì)DPPH·的清除作用

3.3.2 酒黃精多糖對(duì)細(xì)胞抗氧化活性的影響 采用CAA法對(duì)酒黃精多糖提取物細(xì)胞抗氧化活性評(píng)價(jià)表明(圖8)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取5～80 μg·mL-1作為工作濃度，酒黃精多糖抗氧化活性呈正相關(guān)，限值為80 μg·mL-1(工作濃度)，具有最大的細(xì)胞抗氧化活性CAA值(12.31±0.78 μmol QE·100 g-1)。初步證實(shí)該提取法所得的酒黃精多糖都具有抗氧化活性，并呈濃度依賴(lài)性。

圖6 超聲法提取酒黃精多糖細(xì)胞抗氧化(CAA)活性

4 結(jié)論

筆者實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)并及優(yōu)化酒黃精多糖的超聲提取工藝，所得的二次方程模型擬合度較好，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.5991>0.05)，擬合度好，能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)料液比、超聲時(shí)間、溫度對(duì)酒黃精多糖提取率的影響。所得最佳工藝條件為：料液比1∶33，超聲時(shí)間29 min、超聲溫度39℃。在此最優(yōu)提取條件下，提取時(shí)間短，酒黃精多糖提取率高達(dá)7.49%。通過(guò)抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酒黃精多糖濃度在0.2～0.92 mg·mL-1范圍內(nèi)呈一定量效關(guān)系，酒黃精多糖質(zhì)量濃度為0.9104 mg·mL-1時(shí)清除達(dá)到76.50%。當(dāng)酒黃精多糖濃度在5～80 μg·mL-1作為工作濃度時(shí)，抗氧化活性與濃度呈正相關(guān)，限值為80 μg·mL-1(工作濃度)，具有最大的細(xì)胞抗氧化活性CAA值(12.31±0.78 μmol QE·100 g-1)，表明酒黃精多糖具有一定的抗氧化能力。利用超聲波法對(duì)酒黃精多糖進(jìn)行提取，可以節(jié)約時(shí)間，提升工作效率。酒黃精具有較大的開(kāi)發(fā)潛力，本研究可為酒黃精的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。