超聲細(xì)胞粉碎法提取射干總黃酮的工藝研究

齊建紅

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院,陜西 西安 710065)

射干(Belamcandachinensis(L.)DC)為鳶尾科多年生草本藥用植物，在全世界被廣泛用作民間藥物，通常根莖入藥，也有全草入藥，具有清熱消腫、止痛消炎等功效[1]。射干植物的主要藥理活性成分為黃酮及異黃酮化合物[2，3]，劉建英等報(bào)道已經(jīng)分離得到了20多個(gè)黃酮類化合物[4]。這類化合物藥理活性廣泛，在自然界植物中普遍存在,具有抑菌抗過敏、免疫調(diào)節(jié)、保肝抗血栓等藥用保健作用[5]。那么如何高效充分利用這一有效成分資源，我們采用超聲細(xì)胞粉碎這一能夠破碎細(xì)胞，使有效成分充分溶出，操作簡單快速的方法對射干植物中的主要藥理活性成分工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。為植物射干的黃酮類成分在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步充分利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 實(shí)驗(yàn)材料射干，采自紅河谷(陜西秦嶺山脈)，經(jīng)杜喜春老師鑒定為射干屬植物射干，清洗陰干粉碎與密封袋中備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購買于陜西省藥品檢驗(yàn)研究所(純度大于98%)，亞硝酸鈉(NaNO2)、硝酸鋁(AL(NO)3)和乙醇等實(shí)驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)級分析純。紫外-2450型紫外-可見分光光度計(jì)(Japan SHIMADZU)；RE100-Pro旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國賽洛捷克)；JY92-2D型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝)；電子天平(萬分之一級)(German賽多利斯集團(tuán))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)品溶液的制備與最大吸收波長的確定 準(zhǔn)確稱取15 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL燒杯中，加入一定量體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液充分溶解后，再倒入100 mL棕色容量瓶中稀釋定容，混勻可得濃度為0.15 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于10 mL的棕色容量瓶，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]的實(shí)驗(yàn)步驟稍作修改，最后加水定容，搖勻，靜置15 min。在波長為450～550 nm的區(qū)間掃描進(jìn)行最大吸收波長的檢測。

1.2.2 樣品溶液的制備 根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]的方法稍作修改，精密稱取1.1.1項(xiàng)下的射干粉末5.0 g于燒杯中。加入體積分?jǐn)?shù)為60%的一定量乙醇溶液，在一定溫度下于200 W條件下超聲細(xì)胞粉碎法提取一定時(shí)間后，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓抽濾即得上清液。提取3次，合并上清液備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]精密量取0.15 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL放置于10 mL棕色容量瓶中，按照1.2.1項(xiàng)中的方法依次加入試劑。在504 nm波長處測定其吸光度(A)值，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg·mL-1)和A值進(jìn)行黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過不同的單因素試驗(yàn)篩選，對射干總黃酮的主要提取效率的影響因素乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)和料液比(D)進(jìn)行了L9(34)水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從而優(yōu)化篩選射干植物中最佳工藝。

1.2.5 樣品分析 對正交試驗(yàn)溶液按照1.2.3項(xiàng)下方法顯色，再進(jìn)行A值的測定，最后計(jì)算射干植物中總黃酮的得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

從圖1可看出，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在450～ 504 nm 波長范圍內(nèi)A值呈上升趨勢，當(dāng)波長在504～550 nm范圍內(nèi)，A值呈現(xiàn)下降趨勢，從而得出最佳波長測定值為504 nm處。

2.2 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品曲線

通過對1.2.3項(xiàng)中不同濃度A值進(jìn)行測定分析可得回歸方程為Y =12.68X + 0.004，R2= 0.999。蘆丁在0.0 ～ 0.75 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖2)。

表1 因素水平

圖1掃描檢測波長結(jié)果

圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析[8]

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述蘆丁標(biāo)品(0.15 mg·mL-1)溶液3 mL，按照1.2.3項(xiàng)的方法，以不加蘆丁標(biāo)品為空白，用紫外測定504 nm波長處的A值，依次測定6次，得平均A值為0.683，RSD 為1.16%，可以得出儀器的精密度正常。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取射干樣品溶液3 mL，按1.2.3 項(xiàng)中的方法進(jìn)行顯色，分別間隔0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min，在504 nm波長處進(jìn)行A值的測定，結(jié)果在1 h 內(nèi)A值沒有顯著變化，且RSD值為1.17%，表明射干樣品溶液在1 h內(nèi)的顯色結(jié)果是穩(wěn)定。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取射干6 份，按照1.2.2和1.2.3項(xiàng)下的方法制備樣品溶液并進(jìn)行測定，得RSD值為1.35%，表明該方法重現(xiàn)性非常良好。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從正交數(shù)據(jù)和方差分析結(jié)果可知，提取溫度(℃)要素對射干植物中總黃酮成分的提取結(jié)果的影響最為顯著，其次為乙醇濃度(%)因素，再次為固液比(g·mL-1)，最后為提取時(shí)間(min)?？梢缘贸鰧?shí)驗(yàn)的最優(yōu)提取組合條件為A2B2C3D1，射干中總黃酮的最佳工藝為乙醇濃度為80%，提取時(shí)間為10 min，固液比為1∶20，提取溫度為90℃時(shí)，射干植物中總黃酮的含量為4.635 mg·g-1。

表2 正交設(shè)計(jì)結(jié)果L9(34)

表3 正交方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

射干植物在全世界被廣泛用作民間藥物，并且射干植物中的主要化學(xué)成分黃酮類藥理活性廣泛。為了高效充分利用這一有效成分資源，我們對比以往射干植物的提取方法，采用超聲細(xì)胞粉碎的方法，對射干植物中的主要藥理活性成分總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)的最優(yōu)組合條件為A2B2C3D1。射干植物中總黃酮成分的含量為4.635 mg·g-1。該方法能夠破碎細(xì)胞，使有效成分充分溶出，操作簡單快速，并且得率較高。為射干資源的充分利用以及在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的研究提供科學(xué)的理論參考。