毛棉杜鵑花粉活力測定方法研究

白宇清 王定躍 謝利娟

（1深圳市梧桐山風景區(qū)管理處，廣東深圳 518004；2深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，廣東深圳 518055）

杜鵑花是世界4大著名花卉之一，也是我國10大傳統(tǒng)名花之一［1］。其中，毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense Hook.f.）是分布最南的高山杜鵑，為杜鵑花科常綠小喬木，高3～8m，花期3—4月，盛花時粉色花朵覆蓋整個樹冠，觀賞價值極高。毛棉杜鵑的大部分植株自然分布在梧桐山400～700m的較高海拔區(qū)域，而在深圳市區(qū)低海拔地帶未見分布。目前，主要采取將梧桐山的毛棉杜鵑與山下低海拔地區(qū)適應性強的杜鵑雜交，以實現(xiàn)將毛棉杜鵑引種到低海拔地區(qū)的目的。為了便于毛棉杜鵑雜交育種的順利開展，對毛棉杜鵑花粉活力的研究必不可少。

目前，杜鵑花粉常采用醋酸洋紅、TTC以及MTT染色法測定其活力［2-3］，其中，MTT染色法與花粉體內萌發(fā)率最為接近［4］。Brewbaker-Kwack培養(yǎng)基用于測定杜鵑花的花粉活力［5］，該培養(yǎng)基也適用于其他植物花粉培養(yǎng)。國內外對杜鵑花花粉活力的測定方法及離體萌發(fā)培養(yǎng)基配方的研究仍較少，國內僅見有卜志國等［6］對映山紅開花習性與花粉生活力的研究。為此，筆者以毛棉杜鵑花粉為試驗材料，利用蔗糖、H3BO3、CaCl2單因素及正交試驗篩選毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，同時找出快速且適宜的毛棉杜鵑花粉活力測定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料毛棉杜鵑花粉采自深圳梧桐山風景區(qū)小梧桐停車場周邊的野生毛棉杜鵑植株?；ǚ鄄杉髱Щ貙嶒炇页浞只旌喜⒆匀桓稍锛s24～36h，置于-20℃冰箱保存。

1.2 試驗方法在雙孔的凹型載玻片孔內滴入0.1mL的培養(yǎng)液，用牙簽或針將花粉均勻點入培養(yǎng)液中，將載玻片放入保濕的培養(yǎng)皿內于25℃人工氣候箱中，光照培養(yǎng)8h后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計?；ǚ酃荛L度大于或等于花粉粒直徑、四合體有一個萌發(fā)的花粉即視為已萌發(fā)，每處理統(tǒng)計10個視野，每個視野花粉不少于50粒，3個重復。

1.3 試驗處理

1.3.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2單因子試驗 以毛棉杜鵑花粉為試驗材料，蔗糖的質量濃度梯度為0、50、100、150、200、300g·L-1；H3BO3的質量梯度濃度為0、50、100、200、300、500mg·L-1；CaCl2的質量濃度梯度為0、50、100、200、300、500mg·L-1的培養(yǎng)基上進行萌發(fā)試驗。

1.3.2 蔗糖、H3BO3、CaCl2正交試驗 在單因子試驗的基礎上，進行L9（33）的正交試驗。

1.3.3 染色法測定杜鵑花花粉活力 以毛棉杜鵑花粉為測定花粉活力，采用TTC、I2-KI、醋酸洋紅染色法測定花粉活力。

2 結果與分析

2.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2單因子試驗

2.1.1 蔗糖 適當濃度的蔗糖能促進花粉管的萌發(fā)，因為適當濃度的蔗糖能維持花粉與培養(yǎng)基之間的滲透平衡，蔗糖濃度過高導致花粉管破裂，產生質壁分離現(xiàn)象，造成原生質體脫水，花粉不萌發(fā)［7］。由表1可知，蔗糖對毛棉杜鵑花粉管萌發(fā)的影響呈先增加后減小的變化趨勢，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的蔗糖最佳濃度為50～200g·L-1。

表1 蔗糖對毛棉杜鵑花花粉萌發(fā)的影響

2.1.2 H3BO3H3BO3在植物體花中含量最高，其中柱頭和子房的含量最高。H3BO3通過增加糖的吸收、轉運和代謝，促進構成果膠物的合成，即促進花粉管壁的形成。一般花粉中的硼酸含量不足，需從柱頭和花柱中轉運補償，因此在花粉離體培養(yǎng)中要添加一定量的硼酸［8］。由表2可知，H3BO3對毛棉杜鵑花粉管萌發(fā)的影響呈逐漸增加后減小的變化趨勢，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的H3BO3的最佳濃度為50mg·L-1、100mg·L-1、200mg·L-1。

表2 H3BO3對毛棉杜鵑花花粉萌發(fā)的影響

2.1.3 CaCl2CaCl2是花粉萌發(fā)所需的物質，外源Ca2+的需求取決于花粉細胞內游離鈣的含量。若內源鈣充足，外源Ca2+會造成過高的細胞膨壓、細胞中毒抑制花粉的萌發(fā)和花粉管的生長［7-8］。由表3可知，CaCl2對毛棉杜鵑花粉管萌發(fā)的影響呈逐漸增加的趨勢，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的CaCl2最佳濃度為200mg·L-1、300mg·L-1、500mg·L-1。

表3 CaCl2對毛棉杜鵑花花粉萌發(fā)的影響

2.2 蔗糖、H3BO3和CaCl2三因子正交試驗在單因子的基礎上，確立蔗糖、H3BO3、CaCl2的濃度范圍及各濃度梯度，進一步進行L9（33）正交試驗，尋求最佳的培養(yǎng)基配方。由表4可知，毛棉杜鵑花粉在蔗糖200g·L-1、H3BO3100mg·L-1、CaCl2300mg·L-1時萌發(fā)率最高。

表4 毛棉杜鵑花花粉正交試驗的萌發(fā)率

2.3 染色法測定杜鵑花花粉活力從各種染色劑對毛棉杜鵑花花粉的染色效果（圖1）可以看出，TTC染色法測定毛棉杜鵑花花粉活力的效果并不明顯，無法使花粉著色，即使經(jīng)過長時間的染色也無法明確區(qū)分出是否具有活力，故不能作為測定毛棉杜鵑花花粉活力快速有效的染色劑；I2-KI染色法顏色差異不顯著，無法區(qū)分花粉是否具有活力；醋酸洋紅染色法能夠在短時間內使花粉著色，且染色效果明顯，容易區(qū)分，是一種較好的毛棉杜鵑花粉活力測定方法，具有簡單、快捷的優(yōu)點。

圖1 各染色劑對毛棉杜鵑花花粉的染色效果

3 小結與討論

蔗糖是植物花粉萌發(fā)所必需的成分，能為花粉萌發(fā)和花粉管生長提供營養(yǎng)物質，同時維持外界環(huán)境的滲透壓［9］。蔗糖對花粉萌發(fā)的影響，因植物種類和濃度而不同。本試驗結果表明：（1）毛棉杜鵑花粉率萌發(fā)隨著花粉濃度的增加而提高，當蔗糖濃度為200g·L-1時，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)率最高：（2）當硼的濃度為100、200mg·L-1時，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)率最高，當大于200mg·L-1花粉萌發(fā)率逐漸下降：（3）毛棉杜鵑花粉隨CaCl2濃度的增加而持續(xù)增加，說明毛棉杜鵑花粉需要高濃度的CaCl2來促進萌發(fā)。通過正交試驗得出，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為蔗糖200g·L-1+H3BO3100mg·L-1+CaCl2300mg·L-1。

卜志國等［6］研究表明，映山紅的最佳蔗糖濃度為5%，而本研究中液體培養(yǎng)基適宜的蔗糖濃度與之有所不同。姚成義等［10］對藍豬耳花粉萌發(fā)的研究及關軍鋒等［11］對蘋果花粉萌發(fā)和花粉管生長的研究表明，花粉萌發(fā)時不需要外源的存在。本研究中，毛棉杜鵑花粉萌發(fā)結果與他們的研究結果不一致，這是由于不同植物、不同品種的花粉萌發(fā)的條件不同。

染色劑染色測定花粉活力，是一種快速、簡單、快捷的方法。本試驗得出，對于毛棉杜鵑來說，醋酸洋紅染色法法能夠在短時間內使花粉著色，且染色效果明顯、容易區(qū)分，對毛棉杜鵑花粉活力的測定較準確。而TTC染色法和I2-KI染色法則不太適合毛棉杜鵑花花粉活力的測定。